2017 Fiscal Year Research-status Report
卵細胞と精子のATPライブイメージングから生殖細胞のエネルギー代謝の総合理解へ
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15K07036
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| Research Institution | Setsunan University |
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Principal Investigator |
井尻 貴之 摂南大学, 理工学部, 講師 (20629620)
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| Co-Investigator(Kenkyū-buntansha) |
山本 正道 京都大学, 医学研究科, 非常勤講師 (70423150)
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| Project Period (FY) |
2015-04-01 – 2019-03-31
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| Keywords | 卵細胞 / 精子 / ATP / ライブイメージング / エネルギー代謝 |
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| Outline of Annual Research Achievements |
本研究課題ではツメガエル卵細胞とマウス精子のATPに着目し、生殖細胞におけるエネルギー代謝を総合的に理解することを目的としている。今年度は研究代表者の研究室の学部4年生とともに、これまでに得られた結果の再現性を調べ、また立ち上げた実験系を用いて本研究課題を遂行した。
ツメガエル卵細胞の解析では、ミトコンドリアにおけるATP合成酵素の阻害剤（OliA）でも解糖系の阻害剤（2DG）でも卵成熟に影響を与え、これらの阻害効果はATPの注入によりレスキューされることが再確認された。そのため、この条件下で卵細胞の中で起こっているATPの変化を理解するために、タンパク質のリン酸化を解析した（後述）。予備的な新たな知見として、in vitroでの受精系を用いた実験でATP合成阻害剤が受精を阻害し、その阻害効果はATPの分解産物であるアデノシンでレスキューされることを確認した。これらの結果は、カエルの卵細胞ではATP産生に解糖系も利用していることを明らかにしただけでなく、ATPシグナリングの可能性も示唆している。
マウス精子のATP解析では、ATPの含有量が精巣上体尾部から取り出した精子の様々な運動状態や生理条件に影響を与えるのかどうかを調べた。具体的にはin vitroで受精能獲得した精子に含まれるATP量を、ルシフェラーゼ発光法を用いた系により測定した。予想では運動が活性化されることでATP量が増加することを考えたが、実際にATP量を測定してみると受精能獲得した精子ではATP量が減少することが示された。これは、強い運動を続けるためにATP産生が消費に追い付いていないことが原因であると考察できる。
また、昨年度に引き続き、蛍光ATPプローブ（ATeam）をミトコンドリアで発現するノックインマウス系統を作製するため、PCR法で遺伝子型を調べ、ATeam遺伝子をヘテロにもつマウスを選抜した。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
3: Progress in research has been slightly delayed.
Reason
これまでに本研究課題では、ツメガエル卵成熟過程において動物極の表層において次第にATPレベルが増大し、卵核胞崩壊を境に減少に転じるが、また穏やかに増加する様子を捉えた。そして上述のように、卵成熟過程での卵母細胞内のATP変化を理解するため、タンパク質リン酸化を新たに指標とすることにした。そのため予備的に、チロシンリン酸化を広く検出する抗体を用いたウエスタン解析を行ったところ、29kDa付近にリン酸化バンドがみられ、弱いながらも卵成熟過程を通して検出された。一方、ATP合成の阻害剤（2DGとOliA）を加えた卵母細胞では卵成熟誘導後7時間あたりでのみ29kDa付近のバンドが検出されなかった。さらにこの阻害剤の影響もATPの注入によりレスキューされた。今後は、この29kDa付近でリン酸化されるタンパク質を同定する予定である。
また、ATPイメージングのため、精子特異的にミトコンドリアでATeamを発現する遺伝子組換えマウスの準備を進めた。そのために必要となる、精子特異的に組換え反応を起こすStra8-Creマウスを研究代表者の研究室で作製するための系の立ち上げを試みたが、技術不足のために実現しなかった。現在は外部機関の協力を得て、凍結精子から個体化したStra8-Creマウスの作製を行っている。
このようにマウス精子のATPイメージングの進捗が滞っている一方で、第88回日本動物学会大会で5名の演者による「卵生殖を担うシグナル伝達機構」というシンポジウムを主催した。さらに世話人として、第6回生殖若手の会を主催し、本研究課題のマウス精子のATP解析を遂行する上で参考になる知見を得ることができた。
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| Strategy for Future Research Activity |
次年度は国際雑誌への論文発表を最大の目標とする。そのために、既に完成度の高い結果が得られているツメガエル卵細胞の成熟過程におけるATPの解析で必要なデータを集める。その後にATPとミトコンドリアとの関連性を理解するため、ミトコンドリア感受性の蛍光プローブをインジェクションしたアルビノのツメガエル卵母細胞を成熟誘導した上で共焦点レーザー顕微鏡で観察する。
ツメガエルの受精におけるATPの解析では、イメージングよりも確実に結果か得られると考えられるルシフェラーゼ反応を利用したATP量の測定からATPレベルの変化を調べる。
マウス精子のATP解析では、ルシフェラーゼ発光法により200万匹程度の精子に含まれるATP量の測定結果から、様々な運動状態や生理条件における精子のATPレベルを推定するための基礎データを蓄積する。その結果をマウス精子のATPイメージングの際に役立てる。さらに外部機関からStra8-Creマウスの提供を受けたら、直ちにATeam遺伝子をミトコンドリアで発現するノックインマウスとの交配を開始する。その交配の間に、研究分担者の京都大学の山本博士の研究室でマウス精子を対象としたATPイメージングの準備を進める。
また研究代表者は、平成30年度に米国ウズホール海洋生物学研究所で開催される第21回FIR（生殖の最先端）年次シンポジウムでツメガエル卵母細胞の卵成熟過程におけるATP代謝に関する研究成果を発表する。
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| Causes of Carryover |
（理由）
平成29年度も蛍光ATPプローブを精子特異的にミトコンドリアで発現する遺伝子組換えマウスの準備を進めていた。そのために必要な精子特異的に組換え反応を起こすStra8-Creマウスを作製する系を立ち上げるための技術指導を受ける段階で時間を要したことが次年度使用額が生じた理由である。
（使用計画）
最終的に凍結精子から個体化したStra8-Creマウスの提供を外部機関から受けることになったため、その費用にあてる。そして実際に精子を対象にしたATPイメージングを実施する段階で、必要な試薬や培地を購入する計画である。
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