2016 Fiscal Year Research-status Report
温度・圧力依存性に基づく蛋白質異常凝集体およびオリゴマー中間体の熱力学的解析
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15K07038
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| Research Institution | Kindai University |
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Principal Investigator |
櫻井 一正 近畿大学, 先端技術総合研究所, 准教授 (10403015)
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| Co-Investigator(Kenkyū-buntansha) |
李 映昊 大阪大学, たんぱく質研究所, 講師 (70589431)
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| Project Period (FY) |
2015-04-01 – 2018-03-31
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| Keywords | アミロイド線維 / フォールディング / 凝集中間体 / 温度圧力依存性 / 高圧NMR |
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| Outline of Annual Research Achievements |
申請時の研究計画は、(i)：圧力蛍光装置を用いアミロイド線維の構造状態のP（圧力）T（温度）相図を作成する、(ii)：PT相図の形状から、ΔVやΔCpなどの熱力学的パラメータを決定する、(iii)：(i)で見出した条件下で線維もしくはオリゴマーの形成状態を同定する、(iv)：(ii)と(iii)の結果をもとに、オリゴマー中間体の構造と熱力学的性質の関連性を議論する、というものであった。また、αシヌクレイン（αSyn）とβ2ミクログロブリン（β2m）をおもな研究対象と想定していた。
αSynに関しては、αSynアミロイド線維の圧力依存性を測定し、モノマーと線維の二状態転移を仮定して解析することを試みた。はじめにチオフラビンT蛍光によるαSynのアミロイド線維の圧力変性を測定したところ、アミロイド線維の圧力変性は理想的な可逆変性ではないことが発覚した。しかし高圧NMRで線維の圧力変性を観測したところ、高圧変性後のαSynは完全なモノマーに解離しているわけでなく、何らかのオリゴマー構造を形成していると思われる挙動を観測した。現在は、モノマー、線維、オリゴマー各状態の占有数の、圧力依存性を正確に同定することを目指し、今後の速度論的、熱力学的解析に用いることを考えている。
一方β2mに関しては、線維形成初期の中間状態の性質を調べるため、高圧NMR測定を行った。β2m線維も圧力により解離することは知られていたが、実はモノマー状態においてすでにオリゴマー状態との平衡にあり、圧力によってそのポピュレーションを操作できることが分かった。また、そのオリゴマー形成には、キーとなる疎水領域が、分子内だけでなく分子間の相互作用にも働いていることが分かった。今後は、β2mにおいても、モノマー、オリゴマー、線維の三者平衡の圧力依存性を正確に測定することを考えている。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
3: Progress in research has been slightly delayed.
Reason
研究実績の概要で述べた通り、本計画は蛋白質の天然構造と同様に、アミロイド線維が変性状態との理想的な可逆的に状態転移をすることを想定していたが、そのモデルでは解析できないデータが初めから得られた。具体的には、αSynの線維構造は可逆的な圧力変性を示さない、線維の安定性はその形成履歴に依存して安定性が変化する、2状態転移と思われる条件下でもオリゴマー状態が存在すると思われる挙動を示す、などがある。これらの観察結果を満足するモデルを構築するためには、どのような実験を補うべきか苦慮している。当初の想定から大きく異なった経過を経ているため、当初の計画と比較することは難しいが、研究の進行は少し遅れているという判断である。
しかし、これまでの研究から、アミロイド線維には多型があることは報告されている。改めて考えると今回我々が得た結果はもっともらしいものであり、さらに圧力温度摂動を用いることで、さらにそれらの多型の違いを構造レベルで同定できる可能性がある。当初の想定とは異なるものの、新しい知見を提案できるように様々なモデルを検討し、それを支持する実験結果の収集に方向修正したい。
αSynの実験状況が上のように想定外のことがあったため、β2mに関してはモノマー/オリゴマー平衡の系の測定に留まっており、アミロイド線維の圧力依存性測定はまだ着手できていない。測定方法自体はαSynのものを踏襲すればよいので、H29年度初めに着手する予定である。
また別の問題として、蛋白質精製装置の故障などもあり、実験に用いる蛋白質試料の供給が測定実験の進行に対して遅れていたという点も挙げられる。より効率的な試料供給法についても検討したい。
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| Strategy for Future Research Activity |
これまでの実験や測定から分かってきたことは、αSynの挙動は、線維／モノマーという理想的な二状態モデルで解析することができず、オリゴマー（もしくは別種の中間体）も同時に考慮して解析を行う必要があること、また形成条件に依存して線維の構造状態が変わりうることである。そのためには、圧力変性中の線維やオリゴマー種の構造の細かな変化を検出できる方法を多用していかなければならないと考える。
そこで今後の方針として、様々な蛍光分子をプローブとした蛍光測定を行うことが考えられる。現在は線維に特異的に結合するチオフラビンTのみを用いてきたが、申請書に記載したアニリノナフタレンスルホン酸やJC-1などは、分子の状態に応じて蛍光強度が変化するため、線維やオリゴマー状態の中でも違いを認識できると期待される。また、各圧力／温度条件での会合状態を観察するために分析用超遠心、原子間力顕微鏡も多用するべきだと思われる。これらの結果を組み合わせ、モノマー、オリゴマー、線維の存在分布を把握し、熱力学的解析を進めていく。可能であれば、線維の構造状態と線維変性の自由エネルギーの相関も見出すことを目指す。同様の測定を年度初めにβ2mに対して行う。
一方高圧NMRは、線維構造の情報を直接得ることは難しいが、我々が最近行っている化学シフト―主成分解析を適用することで、β2mモノマーからオリゴマー状態に構造変化する段階の初期の構造情報を効果的に得ることができた。この方法をαSynの初期会合反応に対して適用する。
また、αSyn試料供給については、研究室内の発現、精製機器は正常に作動している状況であるが、物性測定に注力する必要があるため、実験補助などを委託し、単純操作は速やかに遂行していきたい。
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[Journal Article] Reduced Lipid Bilayer Thickness Regulates the Aggregation and Cytotoxicity of Amyloid-β.2017
Author(s)
Korshavn K.J., Satriano C., Lin Y., Zhang R., Dulchavsky M., Bhunia A., Ivanova M.I., Lee Y.-H., La Rosa C., Lim M.H., Ramamoorthy A.
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Journal Title
J. Biol. Chem.
Volume: 29
Pages: 4638-4650
DOI
Peer Reviewed / Open Access / Int'l Joint Research
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[Journal Article] Energetic basis on interactions between ferredoxin and ferredoxin NADP+ reductase at varying physiological conditions.2017
Author(s)
Kinoshita M., Kim J.Y., Kume S., Lin Y., Mok K. H., Kataoka Y., Ishimori K., Markova N., Kurisu G., Hase T., Lee Y.-H.
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Journal Title
Biochem. Biophys. Res. Commun.
Volume: 482
Pages: 909-915
DOI
Peer Reviewed / Open Access
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