2015 Fiscal Year Research-status Report
ケミカルジェネティクス法で新規同定したGreatwallキナーゼ標的候補の解析
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15K07041
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| Research Institution | Tokyo Institute of Technology |
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Principal Investigator |
奥村 英一 東京工業大学, 生命理工学研究科, 助教 (00323808)
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| Project Period (FY) |
2015-04-01 – 2018-03-31
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| Keywords | 生体分子 / 生理活性 / 蛋白質 / ゲノム / 染色体 / Gwl / Greatwall / M期 |
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| Outline of Annual Research Achievements |
本研究は、Gwl によるM期進行制御の分子標的解明を目指し、ケミカルジェネティクス法を用いて同定した 15 個の Gwl のリン酸化基質候補の中で、染色体との相互作用が示唆される 1 つのタンパク質について、Gwlの標的候補として特に着目して解析している。初年度は、この標的候補について以下のことが判明した。
まず、このGwl標的候補の遺伝子をクロン化し一次配列情報を得た。これをもとにリコンビナントタンパク質を大腸菌で発現させて精製した。この精製リコンビナントタンパク質を Gwl で処理するとリン酸化された。つまり、標的候補は少なくともin vitroでのGwlの基質であることが判明した。そこで、さらにこのリン酸化部位の同定を目指して、部位解析用の変異体を複数準備している。また、リコンビナントタンパク質を抗原として、標的候補のin vivoにおけるリン酸化解析を行うための抗体作成を行った。ウサギに免疫して、予想分子量のバンドを認識する抗体を得た。このバンドを内在性タンパク質とみなし、間期とM期の状態を比較すると、M期にリン酸化されていた。現在、このリン酸化が Gwl に依存するかを調べている。Gwl活性が低い状態にすると、標的候補のリン酸化は低下する予備的結果を得た。この時、標的候補はGwl非依存的なリン酸化も受けており、それはCdk1によることを新たに見いだした。当初予想していなかったCdk1とGwlによるリン酸化制御ネットワークの存在が示唆された。今後の機能解析では、Gwlによる標的候補リン酸化だけでなく、Cdk1によるリン酸化の組み合わせも考慮する必要が出てきた。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.
Reason
Gwl によるM期進行制御の分子標的としてケミカルジェネティクス法を用いて新規同定した候補タンパク質について、遺伝子をクロン化し、これをもとにリコンビナントタンパク質を調製し、これをGwl によりリン酸化することに成功した。これにより、標的候補はin vitroで、確かにGwlの標的であることを明らかにした。さらに内在性タンパク質を認識する抗体を調製し、内在性タンパク質がM期にリン酸化の修飾を受けることを明らかにしたが、この細胞内でのリン酸化がGwlに依存するかの確証は次年度に持ち越した。しかし、この細胞内でのリン酸化解析を通じて、基質候補がCdk1によるリン酸化も受けることを新たに見いだした。これにより当初予想していなかったCdk1とGwlによる新規基質の制御ネットワークが存在する可能性が出てきた。
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| Strategy for Future Research Activity |
基質候補が少なくともin vitroでのGwlの基質であることが判明したため、今後の課題としては、in vivoでもGwlの基質であるかを明らかにすることが最優先事項と考える。具体的には、細胞内のGwl活性を阻害することで、このリン酸化がGwlに依存するかを調べる。阻害方法には、中和抗体を用いる方法と細胞核ごとGwlを除去する方法がある。これらの手法と、場合によりリコンビナントの基質を導入することで、細胞内でのリン酸化がGwlに依存するかを確かめたい。また、現在調製中のリン酸化部位変異体を用いて、in vitroでのGwlによる基質リン酸化部位を同定する。その部位に対するリン酸化抗体を作成して細胞内でのリン酸化状態を解析し、また、その部位変異体を用いて機能解析を進める。新たに見いだしたCdk1による基質候補のリン酸化についても、Gwlによるリン酸化との関連性などに着目して解析し、Cdk1とGwlによる制御ネットワークの可能性を検討する。
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| Causes of Carryover |
本年は、基質候補が少なくともin vitroでのGwlの基質であることを明らかにすることが出来たが、in vivoでもGwlの基質であるかを明らかにすることは次年度に持ち越された。そのため、細胞内での基質であることを示すために用いる予定であった予算執行が次年度に持ち越された。
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| Expenditure Plan for Carryover Budget |
次年度に持ち越された細胞内でのリン酸化がGwlに依存するかを解析する実験のために当該予算を用いる。また、基質候補がCdk1によるリン酸化も受けることを新たに見いだし、当初予想していなかったCdk1とGwlによる新規基質の制御ネットワークが存在する可能性が出てきたことから、今後の解析においては、GwlだけでなくCdk1による制御との関連性に着目した解析にも当該予算をあてる。これによりさらなる研究の進展を目指す。
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