2016 Fiscal Year Research-status Report
ケミカルジェネティクス法で新規同定したGreatwallキナーゼ標的候補の解析
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15K07041
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| Research Institution | Tokyo Institute of Technology |
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Principal Investigator |
奥村 英一 東京工業大学, 生命理工学院, 助教 (00323808)
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2015-04-01 – 2018-03-31
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| Keywords | 生体分子 / 生理活性 / タンパク質 / ゲノム / 染色体 / Gwl / Greatwall / M期 |
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| Outline of Annual Research Achievements |
本研究は、Gwl によるM期進行制御の分子標的解明を目指し、ケミカルジェネティクス法を用いて同定した 15 個の Gwl のリン酸化基質候補の中で、特に染色体との相互作用が示唆される 1 つの候補タンパク質に着目して解析を行った。初年度に候補タンパク質がin vitroで基質となることを明らかにしたことから発展させ、本年度はin vivoにおいてGwlの基質であるかどうかやGwlによるリン酸化部位を調べ、以下の結果を得た。
1. 初年度に作成した候補タンパク質の抗体を用いて、内在性の候補タンパク質がM期にGwl依存的にリン酸化されるかを調べたところ、電気泳動での移動度の変化を指標とした解析では、Cdk1キナーゼに依存的なリン酸化が移動度に大きく影響しており、Gwlの有無による移動度の違いは明確には検出できなかった。
2. リン酸化部位と予測される部位をアラニンに置換した候補タンパク質の変異体と野生型を基質にして、in vitroでのGwlによるリン酸化部位を２箇所同定した。
3. 同定したリン酸化部位を含む断片ペプチドとそのリン酸化部位をアラニンに置換した変異断片ペプチドを細胞内で発現させたところ、断片ペプチドではM期の移動度の差が観察され、Gwlのリン酸化部位がM期細胞内でリン酸化されることを明らかにできた。
これらより、現在着目し解析しているGwlのM期進行制御の分子標的候補は、実際にGwlのM期の分子標的である可能性が高まり、細胞内におけるGwl依存性とこれらリン酸化の生理的意義を解析することがさらに重要となった。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.
Reason
ケミカルジェネティクス法を用いて新規同定したGwl によるM期進行制御の分子標的候補について、初年度に遺伝子をクロン化し、リコンビナントタンパク質を用いてGwl によりin vitroでリン酸化することに成功していた。また内在性タンパク質を認識する抗体を調製し、内在性タンパク質がM期にリン酸化の修飾を受けることを明らかにしていた。本年度は、in vitroでのリン酸化部位を２箇所同定し、さらに候補タンパク質断片のこれらの部位が細胞内でリン酸化されることを明らかにした。細胞内での解析を行う際、当初断片ではなく全長を基質にして試みていたため可溶性精製タンパク質が得られず研究計画が多少遅れたが、その後断片ペプチドを用いたことで解析が順調に進み、全体としてはおおむね順調に進展している。
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| Strategy for Future Research Activity |
基質候補がin vitroでのGwlの基質であり、そのリン酸化部位を２箇所同定でき、さらに細胞内でそれら部位のリン酸化が起きていたことから、今後の課題としては、in vivoでGwl依存的にリン酸化が起きるかを明らかにすることが重要と考える。具体的方法は、２箇所のリン酸化部位を特異的に認識する抗リン酸化抗体を作成し、まず細胞内でのリン酸化状態を解析する。その後、細胞内のGwl活性を阻害することで、このリン酸化がGwlに依存するかを調べる。阻害方法として、中和抗体を用いる方法と細胞核ごとGwlを除去する方法とを試したい。さらに、リン酸化部位の変異体を用いて細胞内でのGwl基質の機能を解析する。その際、初年度に見出したCdk1による基質候補のリン酸化の意義についても着目し、Cdk1とGwlとの２つのキナーゼによる制御ネットワークの可能性も検討する。
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| Causes of Carryover |
本年度は、基質候補がin vitroでGwlによりリン酸化される２つの部位を同定し、さらに細胞内でこれら部位がリン酸化されることを明らかに出来た。ただし、当初計画した全長タンパク質を用いる解析は試行錯誤したが発現がうまくいかず、タンパク質の一部断片を用いることでようやく達成したものだった。そのため、計画の進捗が遅れが生じてしまい、細胞を用いた解析用に計画した予算執行が次年度に持ち越された。
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| Expenditure Plan for Carryover Budget |
細胞内での２箇所のリン酸化がGwlに依存するかを解析するために抗リン酸化抗体の作成に予算を用いる。また、Gwlによるりん酸化の意義と、さらに初年度に見出したCdk1によるリン酸化制御の意義にも着目し、２つのキナーゼによる制御の解析に当該予算をあてる。
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