2015 Fiscal Year Research-status Report
ミオシン依存的‘力’によるアクチン代謝調節機構の単分子イメージング解析
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15K07045
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| Research Institution | Kyoto University |
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Principal Investigator |
山城 佐和子 京都大学, 生命科学研究科, 助教 (00624347)
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| Project Period (FY) |
2015-04-01 – 2018-03-31
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| Keywords | 一分子イメージング / 細胞運動 / ミオシン / アクチン / メカノセンシング |
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| Outline of Annual Research Achievements |
ミオシンによる力発生はアクチン細胞骨格に収縮力・張力をもたらし、細胞骨格の機能遂行に重要である。近年ミオシン依存的‘力’がアクチン線維寿命を調節する可能性が示唆されている。しかし、力がアクチン安定化またはターンオーバー促進のどちらに作用するか、相反する結果が報告されており不明瞭である。近年、Wilsonら (Wilson et al., Nature, 2010) は、移動性細胞である魚類上皮ケラトサイトにおいて、ミオシンの集積する細胞後部ではアクチンが脱重合側に傾いていること、細胞膜透過処理後にATPを添加するとII型ミオシン依存的にアクチンが脱重合することから、ミオシンがアクチン脱重合を促進すると提唱した。しかし、Wilsonらは、アクチン線維を可視化するプローブとしてコフィリンの結合を阻害する蛍光ファロイジンを用いており、解析に影響している可能性がある。このように、細胞内でミオシン収縮力がアクチン脱重合に与える影響については、明らかでない。
本研究では、運動する細胞において、II型ミオシンによる収縮力がアクチン脱重合に与える影響を明らかにすることを目的とした。魚類ケラトサイトのラメリポディアを観察対象として、蛍光標識アクチンを用いた単分子スペックル法により細胞内アクチン動態を可視化し、II型ミオシン特異的阻害剤Blebbistatinが引き起こすアクチン線維寿命の変化を明らかにした。Blebbistatin添加前と、添加後90-180秒でアクチン線維寿命をRegression 解析により比較したところ、５細胞中４細胞でアクチン線維の半減期が20-33%短縮した。未処理のコントロール細胞では変化がみられなかった。これらの結果から、ケラトサイトのラメリポディアにおいて、II型ミオシン活性はアクチン線維の安定化することを高い確度をもって明らかにした。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.
Reason
本研究では、ミオシン依存的‘力’のアクチン線維寿命調節を可視化解明することを目的としている。そこで本研究では、私が開発した高精度・高効率単分子スペックル法を用いて、ミオシンII特異的阻害剤blebbistatin添加前後のアクチン線維寿命の変化を、連続的な時系列データより秒単位で計測・比較を行っている。昨年度は、移動性細胞である魚類ケラトサイトのラメリポディアを観察対象として、蛍光標識アクチンを用いた単分子スペックル法により細胞内アクチン動態を可視化し、II型ミオシン特異的阻害剤Blebbistatinが引き起こすアクチン線維寿命の変化を明らかにした。その結果から、ケラトサイトのラメリポディアにおいて、II型ミオシン活性はアクチン線維の安定化することを明らかにした。
さらに、本研究において単分子スペックル法による解析で、ケラトサイトのラメリポディアではアクチン線維の半減期が12.3±3.3 秒であること、基質に対してレトログレードアクチンフローが見られることが明らかになった。現在、これまでに得られた結果を報告するため学術論文を投稿準備中であるとともに、引き続き本研究課題を進展させている。
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| Strategy for Future Research Activity |
本研究において、運動する細胞においてII型ミオシンの収縮力がアクチン線維を安定化することが明らかとなった。この結果について、学術論文の投稿及び発表を目指す。
ミオシン収縮力によるアクチン線維安定化が多様なアクトミオシン構造に共通であるか検証するため、分裂期収縮環、ストレスファイバー、ラメラ構造について、明らかにする。また、ミオシン収縮力によるアクチン線維安定化の分子機構を明らかにするため、II型ミオシン特異的阻害剤Blebbistatinがアクチン脱重合因子コフィリンの動態を変化させるかどうか、蛍光タンパク質融合コフィリンの単分子イメージングにより検証する。
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| Causes of Carryover |
当該年度において、学術論文発表に値する成果が得られたため、研究期間の一部において、論文投稿準備を研究の中心とした。次年度は、研究進展のための実験や、投稿論文のリバイスが予定されているため、交付決定額の一部を次年度使用額とした。
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| Expenditure Plan for Carryover Budget |
研究進展のための実験にかかる物品費、及び、成果発表のための学術論文発表と学会発表にかかる経費として使用する計画である。
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