2015 Fiscal Year Research-status Report
ショウジョウバエをモデルとした細胞間接着装置の形成機構の解析
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15K07048
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| Research Institution | National Institute for Physiological Sciences |
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Principal Investigator |
泉 裕士 生理学研究所, 生体機能調節研究領域, 准教授 (10373268)
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| Project Period (FY) |
2015-04-01 – 2018-03-31
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| Keywords | 上皮細胞 / 細胞間接着装置 / ショウジョウバエ |
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| Outline of Annual Research Achievements |
細胞と細胞を繋げる細胞間接着装置はどの様にして形成されるのか？そこには細胞接着分子を含む構成分子を細胞膜上の特定の場所に集積させ、装置を完成させるための特別な仕組みが関わっている。しかし、その分子メカニズムには未だ不明な点が多い。私はショウジョウバエの細胞間接着装置、スムースセプテートジャンクション (以下sSJ)をモデルにしてこの課題に取り組んでいる。これまでに、sSJの構成分子SskそしてMeshの同定に成功し、続いて遺伝学的アプローチによりsSJの正常な形成に必要な分子を探索した。その結果、テトラスパニンタンパク質Tsp2Aなど複数の分子をsSJ形成関連分子として同定した。平成27年度はsSJ形成におけるTsp2Aの機能解析を優先して進め、次に挙げる結果を得た。(1)Tsp2Aに対する抗体の作製に成功し、この分子のsSJへの局在を確認した。(2) CRISPR/Cas9システムによるTsp2Aのショウジョウバエ変異系統の作製に成功し、その中腸におけるsSJ形成の異常が、MeshのsSJ局在異常、及び電子顕微鏡観察によるsSJ形態異常の検出により明らかになった。(3)Tsp2Aの発現抑制により、ショウジョウバエ幼虫の中腸上皮バリア機能が異常になることを確認した。(4)Tsp2Aは、Ssk及びMeshと複合体を形成すると共に、sSJ形成において相互依存的であることが明らかになった。これらの結果より、新規sSJ構成分子Tsp2AはSsk,Meshと協調してsSJ形成に関わっていることが分かった。このTsp2Aの解析結果は、”Journal of Cell Science (2016) 129, 1155-1164”で掲載され、同号における注目論文として”In this issue”で紹介された。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.
Reason
平成27年度の研究実施計画として、次の二項を挙げていた。
(1)sSJ形成におけるテトラスパニン(Tsp2A)の機能解析
(2)sSJ形成における1回膜貫通型ロイシンリッチリピートタンパク質CG4781の機能解析。
(1)に関しては計画通りに研究が進み、研究実績の概要にも記した通りその成果が”Journal of Cell Science (2016) 129, 1155-1164”に掲載された。
(2)に関しては、(1)のTsp2A機能解析とその論文投稿を優先したため、当初の計画通りには進捗していない。しかし、Mesh局在異常の原因遺伝子として同定したCG4781の抗体作製に成功し、GAL4/UASシステムを利用して中腸上皮細胞で発現させたCG4781-GFPと同様に、上皮細胞の側底膜への染色像を示すことを明らかにした。しかし、その染色レベルが低いため、mesh, ssk,Tsp2Aの変異系統における局在変化の検討までには至っていない。また、CRISPR/Cas9システムによるCG4781変異系統の作製にも至っていない。
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| Strategy for Future Research Activity |
平成28年度の研究推進方策については以下の通りである。
(1) sSJ形成における1回膜貫通型ロイシンリッチリピートタンパク質CG4781の機能解析。
平成27年度に引き続き、次の様にCG4781の解析を進める。(A)CG4781をより強く検出できる抗体の作製を検討する。作製出来なかった場合に備え、CG4781-GFPの発現するmesh, ssk, Tsp2A変異系統作製を検討する。(B) CRISPR/Cas9システムを利用したCG4781変異系統の作製を試みる。(C)CG4781変異系統におけるsSJの状態を、Mesh、Ssk、Tsp2Aの局在を指標に検討する。
(2) sSJ形成における1回膜貫通型タンパク質CG13704の機能解析。
Mesh局在異常の原因遺伝子として同定した1回膜貫通型タンパク質CG13704の解析を次の様に進める。(A)CG13704抗体を作成し、中腸上皮細胞での発現及び細胞内局在を解析する。さらに、mesh、sskあるいはTsp2A変異系統における細胞内局在の変化を検討する。(B) CRISPR/Cas9システムを利用したCG13704変異系統作製を試み、Mesh, Ssk, Tsp2Aのに与える影響を解析する。(C)腸管上皮細胞のsSJの形態を、電子顕微鏡により解析する。さらに、ショウジョウバエ幼虫へのトレーサー浸透実験を行う事により、上皮バリア機能への影響を明らかにする。(D)CG13704とMesh、Ssk、Tsp2Aとの相互作用の有無を検討するために共免疫沈降実験を行う。(E)CG13704をS2細胞に発現誘導し、細胞間接着誘導能を検討する。また、Mesh、 Ssk,、Tsp2A、 CG4781と共発現させることにより、Meshの細胞間接着能やSsk, Tsp2A, CG4781の細胞内動態への影響を解析する。
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| Causes of Carryover |
次年度使用額が生じた理由としては、当該年度は論文投稿、及び論文のリビジョンに比較的多くの時間を割いたため実験量が減り、それに伴い消耗品の購入が当初の予定よりも減ったことがあげられる。
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| Expenditure Plan for Carryover Budget |
次年度の使用計画としては、実験量を増やし消耗品の購入を増やすこと、学会の参加のための旅費に使用すること、などを計画している。
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