胚発生de novoメチル化におけるDNMT3作用機序と標的調節

2015 Fiscal Year Research-status Report

• Project/Area Number: 15K07065
• Research Institution: Kumamoto University
• Principal Investigator: 岡野 正樹 熊本大学, 発生医学研究所, 准教授 (50360863)
• Project Period (FY): 2015-04-01 – 2018-03-31
• Keywords: エピジェネティクス / DNAメチル化 / ES細胞

Outline of Annual Research Achievements

本研究は、ゲノムにおける細胞特異的なDNAメチル化修飾を形成する過程「de novoメチル化」について、その制御に中心的な役割をはたすDNAメチル化酵素Dnmt3ファミリーの作用機序の詳細を明らかにすることを目的とする。研究計画初年度である平成２７年度は、計画にしたがい、de novo メチル化制御研究に必要な実験材料（発現プラスミドベクター、遺伝子改変ES細胞）を作製した。本研究では、遺伝子操作により変異を導入したDnmt3をマウスES細胞に発現させ、Dnmt3タンパク質がES細胞ゲノム上のどの位置のクロマチンに結合するか、ゲノム上のどの塩基のDNAメチル化が変化するかを解析する。外部から導入したDnmt3をマウスES細胞内で効率良く発現させるため、PiggyBacシステムを用いたDnmt3発現プラスミドベクターをあらたに構築する。哺乳類がもつ３種のDnmt3ファミリー遺伝子について、各遺伝子のアイソフォーム分子を個別に発現するプラスミドベクターを作製した。さらに、Dnmt3タンパク質機能を調べるため、種々の変異を各Dnmt3遺伝子へ導入し、これらの変異Dnmt3を発現するプラスミドベクターを同様に作製した。一方、本研究課題の解析目的には従来のES細胞株では不十分であるため、本研究の実験内容に適したDnmt3遺伝子改変ES細胞株をあらたに作製した。現在、この細胞株の性状解析をすすめている。以上の進展により、本研究課題の本実験に必要な実験系を構築した。

Current Status of Research Progress

2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.

Reason

初年度の主な目標であった、本実験の遂行に必要なDnmt3発現プラスミドベクター、Dnmt3遺伝子改変ES細胞株はほぼ計画どおりに作製できている。初年度の計画には、作製したDnmt3発現ベクターとES細胞を用いて遺伝子導入実験を開始することも含まれていた。しかし、当該実験において、当初の計画になかった前処理を追加したため、実際のDnmt3発現ベクター導入は次年度に開始するように変更した。具体的には、Dnmt3導入前のES細胞を、特殊培地（2iLIF）による継代培養あるいはDNAメチル化低下薬剤で処理することによって、あらかじめES細胞ゲノムのDNAメチル化レベルを十分にさげておく前培養を追加した。理由は、研究計画後半におけるエピゲノム解析をより正確におこなうためである。

Strategy for Future Research Activity

初年度に作製した発現プラスミドベクターおよび変異ES細胞を用い、研究計画にしたがいDnmt3導入実験を遂行する。

Causes of Carryover

所属機関の変更にともない環境・状況が変化したため、人件費・謝金などの支出内容が変わった。

Expenditure Plan for Carryover Budget

次年度使用額は物品費として当該年度の研究遂行のために使用する。