Mechanism of de novo methylation by DNMT3 in development

2018 Fiscal Year Annual Research Report

• Project/Area Number: 15K07065
• Research Institution: Kumamoto University
• Principal Investigator: 岡野 正樹 熊本大学, 発生医学研究所, 准教授 (50360863)
• Project Period (FY): 2015-04-01 – 2019-03-31
• Keywords: エピジェネティクス / DNAメチル化 / マウスES細胞

Outline of Annual Research Achievements

DNAメチル化酵素Dnmt3ファミリー分子(Dnmt3a, Dnmt3b, Dnmt3L)は、ゲノムDNAの未修飾領域に新たにメチル基を導入する「de novoメチル化」を担う。本研究は、マウスES細胞を用いて、de novoメチル化調節における各Dnmt3ファミリー分子の機能的な違いをあきらかにすることを目的とした。この目的のため、遺伝子ターゲティングによって主要な内因性Dnmt3遺伝子を欠損させたマウスES細胞（Dnmt3a-/-Dnmt3b-/-Dnmt3L-/-）を作製し、各Dnmt3遺伝子を再び導入する実験系を構築した。これらのDNAメチル化状態を解析することによって、各Dnmt3ファミリーに特徴的な傾向を示す結果が得られている。一方、この解析の過程で、当初のDnmt3欠損ES細胞実験系に不十分な点も明らかになった。一つは、遺伝子機能を不活性化させたと考えていたDnmt3L欠損遺伝子から部分欠損タンパク質が生じており、一部の機能が残存していたこと、もう一つは、導入した外来Dnmt3遺伝子発現量のサンプル間のばらつきの影響が大きいことであった。これらの問題を解決するため、まず、ゲノム編集によりDnmt3L遺伝子のほぼ全域を除去し、部分欠損タンパク質が生じないDnmt3欠損ES細胞を再作製した。さらに、細胞に導入する外来Dnmt3遺伝子の発現と同時に、薬剤耐性遺伝子と蛍光レポータータンパク質が発現するプラスミド発現系を作製し、外来Dnmt3遺伝子発現量に応じて細胞を可視化・選別できる実験系を再構築した。これらの改良によって、より信頼性の高いデータを得られることが期待できる。この改良実験系を用いて、DNAメチル化状態に関するデータを再取得している。