2015 Fiscal Year Research-status Report
Arp5による心筋分化制御機構の解明と直接リプログラミングへの応用
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15K07076
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| Research Institution | Osaka University |
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Principal Investigator |
森田 強 大阪大学, 医学(系)研究科(研究院), 助教 (80403195)
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| Project Period (FY) |
2015-04-01 – 2018-03-31
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| Keywords | 心筋 / 分化 / リプログラミング |
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| Outline of Annual Research Achievements |
Actin-related protein 5 (Arp5) は酵母からヒトまで広く保存された核内アクチン様タンパク質であるが、その機能はほとんど知られていなかった。私はArp5が転写調節因子であるMyocardin (Myocd) およびSerum Response Factor (SRF) と直接結合し、それらの機能を抑制することを見出した。Myocd, SRFは共に平滑筋および心筋分化に重要な転写因子であり、実際にArp5の発現減少が血管平滑筋細胞の分化形質維持に重要であることを報告している。そこで、本研究課題では未解明であった心筋分化におけるArp5の機能に注目した解析を行っており、本年度は以下のような研究成果を得ている。
まず、心筋分化におけるArp5の機能を詳細に解析する為にP19CL6細胞を用いてドキシサイクリン(Dox)誘導型のArp5発現抑制株を樹立した。P19CL6細胞はマウス胎児より単離された胚性癌腫細胞であり、DMSOを添加することで心筋細胞へと分化誘導することが可能であり14日ほどで同期拍動を行う心筋細胞コロニーを形成する。Dox存在下、非存在下においてDMSOによる心筋分化誘導を行ったところ、複数のクローンにおいてDoxにより長期間に渡ってArp5の発現量が抑制されることを確認した。さらに、Arp5発現抑制により後期心筋分化マーカー遺伝子であるTnnt2やMyh6の発現が顕著に促進されることが確認された。この結果は、Arp5の発現抑制が心筋分化を促進するという仮説を強く支持している。
また、心筋分化に重要な役割を果たす転写因子MEF2CとMyocdとの結合がArp5により競合的に阻害されることを免疫沈降法により確認した。このことがArp5による筋分化抑制の一因であると考えている。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.
Reason
本研究課題における平成27年度の実験計画は、主に1)Arp5過剰発現および発現抑制による心筋分化遺伝子発現変化の網羅的解析と、2)Arp5によるMyocd, SRF, MEF2C制御機構の解明、の２点であった。研究実績の欄に記したが、1)に関してはArp5発現抑制株の樹立に成功し、実際に心筋マーカー遺伝子の発現に影響が生じることを確認している。また、2)に関してもArp5がMyocd/MEF2C複合体の形成を強く抑制することが明らかとなった。以上のような進行状況から、本研究課題は当初の計画通り順調に進展していると評価した。
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| Strategy for Future Research Activity |
平成27年度の研究によりP19CL6細胞を用いたArp5発現抑制株の樹立に成功した。今後、本細胞株から状態のよいRNAサンプルを調製しDNAマイクロアレイ解析を行う予定である。また、in vivoにおけるArp5の機能解析を行うためにウイルスベクターを用いた心筋でのArp5過剰発現を計画している。これに関しても、Arp5過剰発現により心臓形成や心筋マーカー遺伝子の発現に変化が認められれば、DNAマイクロアレイ等により影響を受けている遺伝子を網羅的に解析する予定である。
さらに、これらの解析結果を受けて、線維芽細胞から心筋細胞へのリプログラミング過程においてArp5の発現抑制による心筋分化効率の改善が可能かどうかを検討する予定である。
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| Causes of Carryover |
当初の計画ではDNAマイクロアレイ解析を平成27年度に行う予定であったが、次年度にずれ込んだため。
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| Expenditure Plan for Carryover Budget |
平成27年度に予定していたDNAマイクロアレイ解析を28年度に行う。
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