2015 Fiscal Year Research-status Report
細胞核ヒストン修飾とミトコンドリア遺伝子機能を繋ぐ転写抑制シグナル
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15K07078
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| Research Institution | Kochi University |
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Principal Investigator |
川村 和夫 高知大学, 教育研究部自然科学系理学部門, 教授 (30136361)
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| Project Period (FY) |
2015-04-01 – 2018-03-31
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| Keywords | ミトコンドリア / ｎｏｎ－ｃｏｄｉｎｇ－ｒｅｇｉｏｎ / 16S リボソームＲＮＡ / ＴＦＡＭ / 加齢 / 出芽 / ホヤ |
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| Outline of Annual Research Achievements |
ミトコンドリアは、ATPや脂肪酸の産生のみならず、生殖細胞分化や細胞死にも関与する多機能オルガネラである。ミトコンドリアゲノムに蓄積される遺伝子変異は、不可逆的な呼吸鎖機能不全を誘発し、加齢や個体死の原因ともなる。
ミサキマメイタボヤは出芽により増殖する。ミトコンドリアの遺伝子機能は、哺乳類同様、加齢に伴い低下するが、出芽とともに復活する。本研究の目的は、加齢と出芽に連動したミトコンドリアの機能低下と活性化の仕組みを明らかにすることである。初年度（平成27年）は、ミトコンドリアnon-coding-region (NCR) を組み込んだレポーター遺伝子を用いて、遺伝子機能を調節するエレメントの解明に取り組んだ。
レポーター遺伝子（PmNCR2.3K/GFP）を、リポフェクション法により成体及び芽体に導入した。レポーター遺伝子は成体の生殖系列細胞で強く発現し、芽体においては上皮性体細胞が強いシグナルを発した。これらの発現パターンは、ミトコンドリア16S rRNAのそれと一致した。次に、遺伝子発現に必要な必須エレメントを同定するため、内部欠失レポーター遺伝子を作製した。NCRの中央部1.4キロを欠くレポーター遺伝子は機能したが、更に32ヌクレオチドを除くと発現が消失した。このヌクレオチドはNCRの3’ 末端近傍に位置し、TATAボックスのモチーフをもっていた。最後に、レポーター遺伝子に対するミトコンドリア転写因子A（TFAM）の働きを調べた。PmTFAM mRNAは、TATAボックス上流の塩基の長さに依存してGFPの発現を促進し、PmNCR2.3Kに対しては、発現量を約5倍に増加させた。これらの結果は、NCRのTATAボックス配列が必須cisエレメントで、その上流に位置する非特異配列は、transエレメントとしてのTFAMが効果的に働くために必要であることを示した。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.
Reason
本研究初年度は、ミトコンドリアD-ループ領域を搭載したレポーター遺伝子が、有性および無性生殖におけるミトコンドリアの活動を再現できることを示したので、これを学術誌に発表する予定であった。研究は順調に進行し、幾つかの手法を改良することで、再現性の高い信頼できる結果を得られるようになった。哺乳類では、ミトコンドリアD-ループ内に存在するプロモーターとその近傍のTFAM結合特異配列がcisエレメントとして重要である。他方ホヤの場合、TFAM結合特異配列は発見されず、TFAMはプロモーター（TATA様ボックス）上流の非特異的配列の長さに依存して、レポーター遺伝子の発現を促進した。これは、ホヤのミトコンドリア転写調節が、哺乳類のそれと異なることを示しており、予想を上回る研究成果であった。
他方、レポーター遺伝子から転写されるmRNAの一部が、細胞質（ミトコンドリア）ではなく、核に出現するという予期せぬ結果に遭遇した。FISH法による追加実験、真核細胞in vitro 転写系を用いた確認実験などが必要となり、実験終了が約半年遅延した。これにより「おおむね順調」の自己評価とした。
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| Strategy for Future Research Activity |
本研究の目的は、ホヤの加齢と出芽に連動したミトコンドリアの機能低下と活性化の仕組みを明らかにすることである。初年度（平成27年）は、ミトコンドリアゲノムの転写調節領域を組み込んだレポーター遺伝子が、有性および無性生殖におけるミトコンドリアの活動を再現できることを証明した。また、核ゲノムがコードするミトコンドリア転写因子（PmTFAM）は、レポーター遺伝子を駆動する最も重要なtransエレメントの一つであることがわかった。PmTFAMは、加齢とともに発現量が低下し、出芽とともに上昇する遺伝子である。次の課題は、PmTFAMの転写調節の仕組みを解明することである。これにより、ミトコンドリアの遺伝子機能が可逆的かつ周期的に変動する分子メカニズムを理解できるものと期待される。
TC14-3は、ヒストンH3リシン27のメチル化を促進する、エピジェネティック因子であり、in vivoでPmTFAMの発現を促進する。これらを統一的に理解するために、次のような作業仮説を立てた。PmTFAMの発現をネガティブに調節する抑制性転写因子があり、TC14-3は、この転写因子をヒストンメチル化によって抑制する。結果的に、TC14-3はPmTFAMの発現を促進する。これまでの予備実験は、TC14-3が抑制性転写因子YY1の発現を抑制すること、PmYY1 5’上流域のヒストンがメチル化されることを示した。YY1がPmTFAMを抑制する結果も得られ始めている。以上の作業仮説と予備実験の結果を高い再現性で証明すること、そのために必要な技術改良を推進することが、本研究2年目の到達目標である。
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| Causes of Carryover |
当該金額（4882円）に合致する消耗品購入予定がなかった。
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| Expenditure Plan for Carryover Budget |
当該金額を次年度に繰り越し、有効利用することとした。
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