2015 Fiscal Year Research-status Report
定量計測と数理モデル化による極性タンパク質の局在領域を決める分子・物理機構の解明
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15K07090
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| Research Institution | Institute of Physical and Chemical Research |
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Principal Investigator |
荒田 幸信 国立研究開発法人理化学研究所, 佐甲細胞情報研究室, 研究員 (40360482)
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| Project Period (FY) |
2015-04-01 – 2018-03-31
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| Keywords | １分子イメージング / 細胞極性 / PAR/aPKCシステム / 拡散距離 / アクトミオシン / パターン形成 |
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| Outline of Annual Research Achievements |
分子反応はナノメートルスケールの分子衝突を介して起こる、一方、細胞極性を担う非対称なタンパク質局在はマイクロメートルスケール（細胞スケール）で形成される。本研究の目的は、極性システムがどのように細胞スケールのタンパク質分布を形成するのかを明らかにすることである。この研究は、分子システムが起こる空間スケールと、受精卵や発生初期胚のパターン形成をつなぐ物理的・分子メカニズムを明らかにする点で発生生物学において重要な課題である。
これまでに、まず研究計画に基づいて局在領域サイズを決定するために重要なタンパク質動態は膜上の拡散距離である可能性を考えた。１分子イメージングによるタンパク質輝点の動きから、PAR-2を含めリン酸化による相互抑制反応を担うPAR/aPKCシステムの６種の極性タンパク質（PAR-2、PAR-1 LGL-1、PAR-6、PAR-3、aPKC）の動態は、cye-1、H26H9.2では顕著な変化が見られなかった。しかし、これらのRNAi胚では、極性維持期ではなく形成期に顕著な異常があることを見つけた。非筋肉型ミオシンNMY-2は、PAR/aPKCシステムの細胞極性形成において、細胞骨格制御を通じて極性の形成期に機能する。このことは、細胞スケールの極性タンパク質の局在領域を規定するのはアクトミオシンの占有領域である可能性が考えられる。次年度からは、PAR/aPKCシステムの細胞骨格制御機構に注目し、極性タンパク質の占有ドメインサイズを決定するメカニズムを明らかにする。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.
Reason
まず研究計画に基づいて局在領域サイズを決定するために重要なタンパク質動態は膜上の拡散距離である可能性を考えた。１分子イメージングによるタンパク質輝点の動きから、拡散距離を決定する滞在時間と拡散速度を計測し、正常胚とドメインサイズが異常になるcye-1、H26H9.2RNAi胚において比較した。予想とは異なり、PAR-2を含めリン酸化による相互抑制反応を担うPAR/aPKCシステムの６種の極性タンパク質（PAR-2、PAR-1 LGL-1、PAR-6、PAR-3、aPKC）の動態は、cye-1、H26H9.2では顕著な変化が見られなかった。しかし、これらのRNAi胚では、極性維持期ではなく形成期に顕著な異常があることを見つけた。
非筋肉型ミオシンNMY-2は、PAR/aPKCシステムの細胞極性形成において、細胞骨格制御を通じて極性の形成期に機能する。NMY-2は形成期に、アクチンネットワークと協働して収縮することにより、細胞膜表層に一様に分布する状態から将来のanterior端へ移動し細胞を半分に区切る極性境界を形成する（極性形成期）。ドメインサイズが異常になるcye-1、H26H9.2では、アクチンの収縮が早いまたは遅いため、形成期に収縮する距離が異なり、結果として極性ドメインの境界は細胞を半割する領域からずれていた。また、par-5 RNAiでもアクトミオシンの収縮が異常で、ドメインサイズが細胞を半割する大きさに収縮できなった。このことは、細胞スケールの極性タンパク質の局在領域を規定するのはアクトミオシンの占有領域である可能性が考えられる。次年度からは、PAR/aPKCシステムの細胞骨格制御機構に注目し、極性タンパク質の占有ドメインサイズを決定するメカニズムを明らかにする。
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| Strategy for Future Research Activity |
H27年度の解析により、ドメインサイズの決定機構は予想していたより長い時間スケールで起こるPAR/aPKCシステムの細胞骨格制御システムと関係がある可能性が出てきた。来年度からは、当初計画していたリン酸化による相互抑制反応を担う因子の解析と同様に、NMY-2細胞内動態を１分子計測と数理モデルを用いたボトムアップの解析から明らかにする。同時に、仮説検証型のアプローチも採用する。アクトミオシンの収縮は極性形成だけでなく細胞質分裂も主導する。Oegemaらは、アクトミオシンが細胞サイズに依存、非依存の二過程での収縮し細胞質分裂を制御することを見つけた。彼女らは、アクトミオシンが形成するメッシュ目に特徴的なサイズを持っている事、およびメッシュ目ごとの収縮は一定割合でしか起こらないことを仮定して、細胞分裂のサイズ依存的過程を説明した。このモデルでは、大きな細胞では小さい細胞に比べ、より多くのメッシュの目が分裂開始前の細胞分裂軸上を取り囲むため、収縮する単位の数が多くなり細胞が大きい方が収縮が早くなるというモデルである。この仮説が極性タンパク質の局在領域サイズの細胞サイズ不変性にも適応可能かを検証する。極性タンパク質の局在ドメインサイズは細胞のサイズが変わってもドメインサイズの比（細胞サイズの半分）は変化しないが、絶対的なサイズは変化する。この振る舞いは、極性ドメインのサイズが細胞の大きさに柔軟に変化できることを示している。NMY-2が集合してできるfociの密度が、極性形成の初期と後期で変化するのか、さらにcye-1、H26H9.2のRNAiによる遺伝子ノックダウンでの密度の変化を細胞サイズを変化させ調べることにより、Oegemaらの仮説が細胞極性システムのサイズ依存性を説明できるかを明らかにする。
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| Causes of Carryover |
本課題予算で購入予定であったMATLABプログラムは、研究室全体予算から購入することになり、資金を効率的に使うために個人ライセンスを購入することを急遽取りやめた。代わりに、この予算を本研究課題を効率的に遂行するために現在使用しているものよりも高解像度の実体顕微鏡の購入に充てた。以前のものよりも線虫個体から卵を取り出し１分子イメージング用の観察用サンプルを作成する効率が上がった。差額分がほぼ次年度繰越となった。
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| Expenditure Plan for Carryover Budget |
生じた差額は、新たに計測対象となったPAR/aPKCシステムの細胞骨格系構成因子NMY-2とアクチンおよび複数の骨格制御系因子のイメージングのため、蛍光タンパク質との融合タンパクを発現する線虫株の取り寄せ、または作成のために使う。また、対象因子のRNAiを行うための二重差RNAを合成するための分子生物学系消耗品の購入に充てる。
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Research Products
(1 results)
