2015 Fiscal Year Research-status Report
チオレドキシンを介した光合成電子伝達依存的な転写制御機構の解明
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15K07096
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| Research Institution | Saitama University |
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Principal Investigator |
日原 由香子 埼玉大学, 理工学研究科, 准教授 (60323375)
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| Project Period (FY) |
2015-04-01 – 2018-03-31
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| Keywords | 転写因子 / シアノバクテリア / レドックス制御 / チオレドキシン |
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| Outline of Annual Research Achievements |
これまでに、チオレドキシンと転写因子との相互作用を検出するために開発した、大腸菌共発現株を用いたスクリーニングの系において、Synechocystis sp. PCC 6803のSll1961転写因子が、チオレドキシンと相互作用する結果を得ていた。今年度は、野生型、およびSll1961に存在する3つのシステイン残基C124、C229、C307をアラニンに置換した変異型タンパク質をそれぞれ大腸菌より精製し、精製チオレドキシンとの相互作用を検証した。チオール基修飾試薬PEG-maleimideを用いた解析により、システイン残基のレドックス状態を調べたところ、酸化条件下ではC229とC307が分子内ジスルフィド結合を形成すること、チオレドキシンとの相互作用により可逆的に還元されることを見出した。また、酸化還元処理を行ったSll1961タンパク質をトリプシン消化し、TOF-MS解析に供したところ、C229とC307の分子内ジスルフィド形成に由来すると考えられるペプチド鎖が、酸化サンプルで検出された。さらに、酸化還元処理を行ったSll1961タンパク質をHPLC解析に供したところ、酸化還元状態によらず、Sll1961タンパク質は二量体として検出された。以上の結果より、Sll1961はシステインを介さず二量体を形成しており、酸化条件下ではC229とC307の分子内ジスルフィド結合形成により構造変化・活性変化が起きる、というスキームが考えられる。今後、in vivoでのSll1961の存在状態を検出することにより、このような構造変化・活性変化、およびチオレドキシンとの相互作用が実際に起きているかどうか、検証を行う予定である。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.
Reason
Sll1961タンパク質がチオレドキシンと相互作用するというスクリーニング結果を、精製タンパク質を用いた解析で実証することができた。さらに、システイン置換型タンパク質を用いて、チオレドキシンとの相互作用および分子間ジスルフィド結合形成に、C229とC307が関与することを示唆する結果を得ることができた。これらのタンパク質を用いたDNAゲルシフトアッセイにより、推定標的遺伝子上流域への結合能が、システインの酸化還元状態によりどのような影響を受けるか調べようとしたが、今のところSll1961タンパク質のDNA結合活性を検出できていない。この点については今後、反応液組成の検討を行っていく必要がある。
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| Strategy for Future Research Activity |
これまでにin vitroにおいて、Sll1961タンパク質のチオレドキシンとの相互作用、およびシステイン残基のレドックス変化の解析を行い、一定の成果を得ることができた。今後はin vivoにおいて、どのような環境条件下でチオレドキシンとの相互作用やシステインのレドックス変化が起きるのか、解析を行う必要がある。そのために、現在、Blue Native-PAGEにより、天然状態のSll1961タンパク質を、Synechocystis sp. PCC 6803の粗抽出液より抗体検出することを試みている。さらに今後、in vivoでのシステインのレドックス状態をPEG-maleimide修飾により検出する系を構築する予定である。
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| Causes of Carryover |
シアノバクテリアにおいて転写因子欠損株を作製し、その株において遺伝子発現解析や代謝解析を行う場合、外注費用が必要となる。しかし、当該年度は精製タンパク質を用いたin vitro解析を主に行ったため、外注での支出が生じなかった。
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| Expenditure Plan for Carryover Budget |
次年度はシアノバクテリア変異株を用いたin vivo解析を主に行うことを予定している。繰り越した643,652円は、これらの株の遺伝子発現解析や代謝解析の外注費用として用いる予定である。
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