2016 Fiscal Year Research-status Report
嫌気実験系を利用したニトロゲナーゼのレドックス制御機構の解明
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15K07099
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| Research Institution | Tokyo Institute of Technology |
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Principal Investigator |
野亦 次郎 東京工業大学, 科学技術創成研究院, 助教 (40583216)
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| Project Period (FY) |
2015-04-01 – 2018-03-31
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| Keywords | 酸素感受性 / 金属中心 / ニトロゲナーゼ |
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| Outline of Annual Research Achievements |
チオレドキシン（Trx）は生物界に広く分布し様々な代謝系を触媒する酵素(蛋白質)の活性を調節する重要な蛋白質である。Trxは、その活性部位にある2つのシステイン残基のチオール基(-SH)によって標的蛋白質のジスルフィド結合(S-S)を還元し、この反応により標的蛋白質の活性が調節される。最近、私達は窒素固定性ラン藻、Anabaena sp. PCC7120(A.7120)において、TrxのアイソフォームのひとつであるTrxM1が窒素固定酵素ニトロゲナーゼと相互作用するという興味深い結果を得た（J.Biochem. 2015）。ニトロゲナーゼは分子状 窒素(N2)をアンモニアに還元する複雑な金属酵素であり、この地球上における全窒素固定量の50%を占めるなど、窒素動態において極めて重要な酵素である。ニトロゲナーゼは還元コンポーネント(NifHホモ二量体)と触媒コンポーネント(NifD-NifKヘテロ四量体)から構成されるが、そのいずれも『金属中心』を保持しているため、分子状酸素に触れると数分で不可逆的に酵素活性を失うことが知られている。これまでにニトロゲナーゼがTrxにより活性制御されるという報告はなく、本研究では、A.7120において、TrxM1がニトロゲナーゼの活性を制御するのか検証することを目的とする。目的達成のため、嫌気条件下での生化学的解析の研究基盤構築を目指している。申請者は、紅色細菌を用いた発現系の構築を行い 、金属中心の形成されたNifHタンパク質を得ることに成功している。一方、NifD-NifKタンパク質は、窒素固定性藍藻を用いた発現系を作製し、現在発現系の検討を行っている。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
3: Progress in research has been slightly delayed.
Reason
本研究計画では、Trxのひとつ、TrxM1によるニトロゲナーゼ活性の制御を検証することを目的とする。そのためには、精製したNifHタンパク質とNifD-NifKタンパク質の両方を用いたin vitro活性再構成系によって評価する必要がある。NifHについては、紅色細菌を利用した発現系を構築し、金属中心を保持した状態で精製することに成功した。一方、NifD-NifKタンパク質の活性型発現については、窒素固定細菌Azotobacter vinelandii や窒素固定性藍藻など様々な発現系の検討を行ったが、精製タンパク質を得るに至っていない。
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| Strategy for Future Research Activity |
NifD-NifKタンパク質について、窒素固定性藍藻を窒素欠乏条件下で生育し、ニトロゲナーゼのNifD-NifKタンパク質が発現した細胞の抽出液を利用する。嫌気条件下で調整した藍藻の抽出液を、精製したNifHと組み合わせることで、NifHの活性を評価するin vitro実験系を構築する。この系を利用し、A.7120のNifHの生化学的諸性質や、NifHに保存されているシステイン残基の意義、レドックス制御の可能性について検討する。
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