2016 Fiscal Year Research-status Report
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15K07107
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| Research Institution | Nara Institute of Science and Technology |
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Principal Investigator |
加藤 晃 奈良先端科学技術大学院大学, バイオサイエンス研究科, 准教授 (80283935)
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| Project Period (FY) |
2015-04-01 – 2018-03-31
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| Keywords | 翻訳制御 / 環境ストレス / 植物培養細胞 / ゲノムワイド解析 / 5’UTR |
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| Outline of Annual Research Achievements |
昨年度までに選抜した候補5’UTRの中で、熱ストレス下では翻訳が抑制され塩ストレス下では翻訳が維持されるAt1g09970やAt5g13180 mRNAの5’UTR(142および67塩基、転写開始点が条件間で一致)を35Sプロモーターの支配下でレポーターFLUC遺伝子と連結したバイナリーベクターを、それぞれシロイヌナズナ培養細胞T87に導入した形質転換培養細胞を作出し、ポリソーム/定量RT-PCR解析を行った。結果、それぞれの5’UTRを連結した FLUC mRNA は、内在性 At1g09970およびAt5g13180 mRNAと同様に、熱ストレス下と比較して、塩ストレス下で翻訳が維持される挙動を示した。これら5’UTRは、熱抑制/塩維持のストレス種特異的な翻訳状態に寄与し、熱抑制/塩維持のストレス種特異的な 翻訳状態を規定する要因としての5’UTRの重要性が示唆された。
また、各条件で転写開始点が変化していた6種（At1g16030, At1g53540, At3g08970, At1g70300, At2g46240, At5g37340）の候補遺伝子の5’UTRについて、それぞれ変化前後の5’UTRを連結した、cap構造、ポリA配列を有する合成FLUC mRNAをin vitroで合成し、プロトプラストに導入した。その後、通常条件 (22℃)および熱ストレス条件下 (37℃)に 20分間静置後、それぞれのFLUC活性値を測定した。結果として、FLUC活性値は、転写開始点変化前後の 5’UTR間で異なり、ストレスに応答した転写開始点の変化は、mRNAの熱ストレス下での翻訳活性を変化させることが示された。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.
Reason
シロイヌナズナ培養細胞の通常条件、熱ストレス条件、塩ストレス条件のいずれにおいても転写開始点が変化していなかった2遺伝子については、キメラ遺伝子を導入した安定形質転換体を用いた解析を、また、条件間で転写開始点が6変化していた遺伝子については、変化前後の5’UTRを連結したin vitroで合成したmRNAを用いた一過性発現実験により、それぞれの特性を評価し、当初の予定どおり研究が進展している。
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| Strategy for Future Research Activity |
形質転換体を用いた解析より、ストレス種特異的な翻訳状態変化を規定する要因としての5’UTRの重要性が示された。用いた5’UTR内に、ストレス種特異的な翻訳状態変化を規定する制御配列が存在すると考えられる。また、熱抑制/塩維持という翻訳の挙動を示す候補 mRNAの5’UTRに限定すると、CU反復という共通性が認められた。例えば、At1g09970 5’UTR内(148塩基)には、5’末端から数えて 22～74塩基に13×CU反復が認められた。また、At5g13180 5’UTR内(67塩基)には、5’末端から数えて 9～67塩基の間に4×CU反復およびCU rich領域が認められた。このことから、5’UTR内に存在するCU反復領域やCU rich領域が、熱抑制/塩維持というストレスの種類に特異的な翻訳状態変化に関係している可能性が考えられた。もし、CU反復領域等が翻訳制御に関わる制御配列ならば、ゲノムワイドな解析（CU反復領域やCU rich領域を持つmRNAの翻訳挙動）においても、同様の傾向が認められると考えられた。そのため、次にCAGE解析によって転写開始点(5’UTR)を網羅的に同定し、得られたデータを用いて、5’UTR内にCU反復領域等を有するmRNAのストレスに応答した翻訳状態変化を網羅的に解析する。また、CU反復が熱抑制/塩維持のストレス種特異的な翻訳制御に寄与しているのか調べるために、変異を導入したキメラ5’UTRを連結したレポーター遺伝子を発現する形質転換体を用いた解析を行う。
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| Causes of Carryover |
当初計画していた安定形質転換体を用いた解析の一部を次年度実施分とした。
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| Expenditure Plan for Carryover Budget |
28年度実施予定分と29年度実施計画分を合わせて解析にかかる消耗品費として使用する。
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