2015 Fiscal Year Research-status Report
網羅的アミノ酸置換による光化学系IIの水素結合ネットワークの機能に関する研究
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15K07110
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| Research Institution | Okayama University |
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Principal Investigator |
黒田 洋詩 岡山大学, 自然科学研究科, 助教 (80381903)
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2015-04-01 – 2018-03-31
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| Keywords | 光合成 / 光化学系II / クラミドモナス / 葉緑体形質転換 |
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| Outline of Annual Research Achievements |
我々は酸素発生型光合成における光化学系II複合体の酸素発生系とルーメンを繋ぐ3つの水素結合ネットワークの機能の解明を目指し，モデル生物の一つである緑藻クラミドモナスを用いて研究を行っている．この水素結合ネットワークは光化学系IIのサブユニットタンパク質（D1, D2, CP43, CP47タンパク質）のアミノ酸残基と水分子から構成されている．これらのタンパク質は葉緑体ゲノムにコードされているので，我々は葉緑体形質転換法を用いて，水素結合ネットワークに関与するアミノ酸残基それぞれを19種類の別のアミノ酸へ置換する網羅的改変を行い，光合成活性にどのような影響が出るかを調べている．
平成27年度には，変異株の作出の完了していた10カ所に加え，新たに変異株を作出中であったアミノ酸残基4カ所について，それぞれ19種類の変異株の作出を完了させた．また，二次電子受容体であるYZ (D1-Y161)またはYD (D2-Y160)をフェニルアラニンに置換した変異株も作出した．
変異株の作出と並行して，これまでに得られていた変異株の表現型，光化学系IIの蓄積および酸素発生活性を解析した．変異を導入しても光合成活性や光化学系IIの蓄積量にほとんど影響のないアミノ酸残基もあったが，光化学系IIは正常に蓄積しているにもかかわらず光合成できない変異株も数多く見受けられた．それらの中には，酸素発生系が正常に構築されていないと考えられる変異株や酸素発生系におけるS状態遷移が特定の段階で阻害されたような変異株があった．これまでの結果から，酸素発生系からのプロトン排出において，複数の水素結合ネットワークがS状態遷移の各段階で使い分けられている可能性が示唆された．
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.
Reason
新たに4カ所のアミノ酸残基（D2-R294，D2-E302，D2-E312，D2-E323）について，それぞれ19種類ずつの変異株を作出した．二次電子受容体であるD1-Y161 (YZ)または D2-Y160 (YD)をフェニルアラニンに置換した変異株も作出した．
これまでに作出済みだった変異株のうち，D1-F339変異株およびD1-E65変異株の光合成的生育，光化学系IIの蓄積量，酸素発生活性を調べた．また，新たに作出したD2-R294変異株についても同様の解析を行った．D2-R294残基は酸素発生系から離れた位置に局在するが，その変異は光合成活性を著しく低下させた．この変異株の多くは嫌気条件下でよく生育するため，酸素の存在下で光阻害を受けやすいと考えられた．
D1-N298変異株の熱発光の測定で検出されるシグナルの由来を同定するため，いくつかのD1-N298変異とD2-Y160F変異をもつ二重変異株を作出した．その結果，当初D2-Y160に由来すると考えていた熱発光シグナルが別のものに由来することを確認できた．
D1-N298変異株を用いて，光化学系IIのMn定量およびQAからQB/QB-への電子伝達速度の測定を行った．また，D1-D61変異株およびD1-R334変異株については，Mn定量に加えて，酸素発生系におけるS状態遷移を調べるために熱発光の測定を行った．特にD1-N298変異株やD1-D61変異株では，酸素発生系におけるS状態遷移が特定の段階で阻害されている株が見受けられた．これらのアミノ酸残基は，酸素発生系への水分子の流入や酸素発生系からのプロトンの排出に重要な役割を果たしていると考えられる．さらに，酸素発生系が正常に構築されていないと思われる変異株もあり，水素結合ネットワークが酸素発生系の構築に何らかの役割を果たす可能性が示唆された．
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| Strategy for Future Research Activity |
当初の予定通り，水素結合ネットワークに関与するアミノ酸残基の変異株の作出と解析を行う．D2-K317変異株の作出は残り14種類．CP47-E364は19種類の形質転換ベクターを完成させているので，形質転換が可能な状態にある．CP43-R320とCP43-K339は形質転換ベクター作りから行う．酸素発生系であるMn4CaO5クラスターと直接結合しているアミノ酸残基，既に機能が報告されているアミノ酸残基および異なる種間で保存されていないアミノ酸残基については，数種類ずつの変異株の作出にとどめ，作出済みの変異株の解析に重点を置く予定である．
昨年度までの研究から，D1-N298変異株以外に，D2-R294, D1-D61, D1-E65およびD2-E312変異株の中に非常に興味深い表現型を示す株が多く存在した．本年度にはこれらの変異株を用いて，より詳細な活性測定を行う予定である．
これまでのところ，光合成活性の測定には生細胞を用いているが，より詳細な解析を行うためには光化学系II複合体を精製する必要がある．短時間で簡便に光化学系II複合体を精製するために，CP47サブユニットへアフィニティ精製タグを付加した変異型光化学系IIを持つ変異株を作出する．文献ではHis6 tagを用いたアフィニティ精製が報告されているが，精製標品がアグリゲーションしやすいという問題点があるらしい．そこで，His6 tag以外にStrep tag IIの利用も考えている．まず，何種類かのD1-N298変異株およびD2-R294変異株について，アフィニティ・タグの付加を行う予定である．
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| Causes of Carryover |
形質転換体の作出が失敗無く順調に進み，予備の使用を見込んでいた試薬などの支出を節約することが出来たため，若干の残高が生じました．
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| Expenditure Plan for Carryover Budget |
解析する形質転換体の数がかなり増えたため，その解析のために使用する試薬の使用量の増加が見込まれます．また，論文投稿も予定しており，それらの経費として残金を使用する予定です．
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