2016 Fiscal Year Research-status Report
網羅的アミノ酸置換による光化学系IIの水素結合ネットワークの機能に関する研究
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15K07110
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| Research Institution | Okayama University |
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Principal Investigator |
黒田 洋詩 岡山大学, 異分野基礎科学研究所, 特別契約職員(講師) (80381903)
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| Project Period (FY) |
2015-04-01 – 2018-03-31
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| Keywords | 光合成 |
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| Outline of Annual Research Achievements |
我々は酸素発生型光合成における光化学系II複合体の酸素発生系とルーメンを繋ぐ3つの水素結合ネットワークの機能の解明を目指し，モデル生物の一つである緑藻クラミドモナスを用いて研究を行っている．この水素結合ネットワークは光化学系IIのサブユニットタンパク質（D1, D2, CP43, CP47タンパク質）のアミノ酸残基と水分子から構成されている．これらのタンパク質は葉緑体ゲノムにコードされているので，我々は葉緑体形質転換法を用いて，水素結合ネットワークに関与するアミノ酸残基それぞれを19種類の別のアミノ酸へ置換する網羅的改変を行い，光合成活性にどのような影響が出るかを調べた．
平成28年度には，これまでに作出済みであった１４種類の変異株のうち，D2-R294，D2-E312，CP43-A411変異株の表現型，光化学系II蓄積量，活性を解析した．変異を導入しても光合成活性や光化学系IIの蓄積量にほとんど影響のないアミノ酸残基もあったが，光化学系IIは正常に蓄積しているにもかかわらず光合成できない変異株も数多く見受けられた．それらの中には，酸素発生系が正常に構築されていないと考えられる変異株や酸素発生系におけるS状態遷移が特定の段階で阻害されたような変異株があった．また，酸素発生系の光活性化に重要と思われるアミノ酸残基や光合成電子伝達成分の酸化還元状態に重要かもしれないアミノ酸残基も見つかった．これまでの解析結果と総合し，プロトン排出に関与している可能性のある水素結合ネットワークとそうでないものを区別することが出来，平成29年度に重点的に解析すべきターゲットを絞り込むことが出来たと考えられる．
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.
Reason
平成２８年度には，これまでに作出していた形質転換体の解析を重点的に行った．特に，CP43-A411変異株およびD2-E312変異株の光合成的生育，光化学系IIの蓄積量，酸素発生活性を調べた．これらの解析により，当初プロトン排出経路と考えられていた水素結合ネットワークが実際には関与していない可能性を示唆する結果を得た．
D2-R294を含む水素結合ネットワークはMn4CaO5クラスターからルーメンへとつながっており，水酸化の結果生成したプロトンの排出経路と考えられているが，D2-R294よりMn4CaO5に近いアミノ酸残基への変異（D2-E302およびD2-E323）は予想に反して酸素発生活性にそれほど大きな影響を与えなかった．このことから，D2-R294はYDの機能に重要である可能性が出てきた．その可能性を調べるために，YDおよびD2-R294の二重変異株を作成した．
D2-R294残基への変異は光合成活性を著しく低下させ，酸素の存在下で光阻害を受けやすいが，比較的強い光強度で生育させると，変異株のPSII蓄積量や光合成活性がコントロール株に近づいた．このことから，D2-R294は酸素発生系の活性化になんらかの役割を果たしている可能性が考えられた．
D1-N298変異株を用いて，光化学系IIのMn定量およびQA-からQB/QB-への電子伝達速度の測定を行い，還元側の機能はあまり影響を受けていないことを確認した．また，共同研究により，酸素発生活性を検出できなかった変異株の閃光照射による活性測定を行なった結果，酸素発生系の急速な失活でなく，S状態遷移が正常に起こらないために酸素発生しないことが確認できた．
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| Strategy for Future Research Activity |
平成２９年度には，形質転換体の作出は最低限にとどめ，変異株の解析を中心に研究を行う．当初の計画では，光化学系II複合体の単離のためにアフィニティ・タグを利用する予定であったが，必ずしもその必要がないことが分かったため，計画を変更する．活性測定には生細胞または単離したチラコイド膜を用いる予定である．
D1-D61から始まる水素結合ネットワークに関して，D2-R294の機能を明確にするために，昨年度末にYDとの二重変異株を作出した．その解析により，D2-R294とYDの機能的な関連性を明らかにできると考えている．また，D1-E65およびD2-E312への変異は，光化学系II複合体の蓄積には大きな影響を値なかったが，酸素発生活性は大きく低下していた．これらの役割を明らかにするために，Mn定量を行う必要がある．その結果を通して，これらのアミノ酸残基が光化学系IIの構築や活性化ではなく，プロトン排出に大きく関与していることを明らかにしたい．
YZから始まる水素結合ネットワークに関しては，まだ詳細な解析を行っていないD1-N322変異株の解析を行い，このネットワークの機能解析に関する研究を完結させる予定である．
以上のように，２つの異なる水素結合ネットワークの機能解析のために，多くの形質転換体を作出してきた．これらの解析結果を統合し，どのネットワークがどの段階でプロトン排出に関与するかを明らかにする予定である．
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| Causes of Carryover |
形質転換体の作出や解析が順調に進み，試薬などの支出を抑えることができたことと，論文の投稿が平成29年度にずれ込んでしまったため，残高が生じました．
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| Expenditure Plan for Carryover Budget |
形質転換体の解析に使用する試薬類の増加が見込まれます．また，複数の論文投稿も予定しており，その経費として使用する予定です．
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