2016 Fiscal Year Research-status Report
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15K07112
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| Research Institution | University of Hyogo |
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Principal Investigator |
菓子野 康浩 兵庫県立大学, 生命理学研究科, 准教授 (20221872)
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| Project Period (FY) |
2015-04-01 – 2018-03-31
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| Keywords | 光化学系II複合体 / クロロフィル合成 / 膜タンパク質複合体 / シアノバクテリア |
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| Outline of Annual Research Achievements |
シアノバクテリアSynechocystis sp. PCC 6803の光化学系II（系II）複合体構築の最初期に、11種の機能未知タンパク質（Slr0172、Sll1398、Slr1128、Sll1099、Slr0399。Sll1390、Slr0013、slr0483、Sll1106、slr0670、slr1739）が係わることが研究代表者により予想されている。前年度までに作出に取り組んだ５種の欠失変異体の中で、Sll1099の完全変異体化に引き続き取り組んだ。しかし依然、親株として野生株を用いた場合でも完全変異体は作出できなかったため、系IIの構築あるいは細胞の生存に必須の因子であると見られる。残りの6種のタンパク質についても、欠失変異体とC末端へのHis-tag融合体の作出を進めた。すでに作出できたHis-tag融合変異体から、未成熟系II複合体の精製を進めた。
また、光合成色素結合タンパク質の精製を進める過程で、界面活性剤dedecyl-α-D-maltoside（α-DDM）を用いて膜タンパク質を可溶化すると、これまで用いてきたdodecyl-β-D-maltosideより、より健全な複合体の精製が可能であることが分かってきた。そのため、すでに作出したHis-tag融合変異株を用い、α-DDMによる可溶化を行い、構築初期にある系II複合体の精製条件の検討を進めた。さらに、タンパク質の網羅的解析には等電点電気泳動を用いた二次元電気泳動が多用されるが、一般に用いられる等電点電気泳動では系II複合体のような膜タンパク質が分離されない。そこで、構築過程にある系II複合体を構成するタンパク質の網羅的解析のために、DNAのような巨大分子の分離にも使われるアガロースを用いた等電点電気泳動の改良に取り組み、膜タンパク質を分離するための目安となる条件を絞り込むことができた。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
3: Progress in research has been slightly delayed.
Reason
得られたHis-tag融合変異体を用いてタンパク質の精製を行い、精製標品中に複数のタンパク質を電気泳動的に確認できているが、いずれの変異体においてもMnの解析を行っておらず、Mnクラスター形成時期の特定には至っていない。また、他種シアノバクテリアの相同遺伝子との入れ替え実験を計画していたが、Synechocystis sp. PCC 6803本来のタンパク質機能解析を優先して進めた。これらのため、「やや遅れている」とした。しかし、Mn定量は研究室で行うことができる状態にあるので、複数の構築段階の標品を得て、早急にMnの解析を進めることができる。また、好熱性シアノバクテリアのゲノムDNAも確保済みなので、相同遺伝子の入れ替え実験も早急に進めることができる。
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| Strategy for Future Research Activity |
引き続き、これまでに作出した各種の変異株を用い、光により光化学系II複合体の構築を人為的に誘導し、系IIの構築初期の部分的集合体を同調的に生産させる。そして、His-tagを導入した各種のタンパク質を精製する。このときに精製されてくる「半端な」複合体の構成成分を網羅的に解析する。この際、膜タンパク質を可溶化する界面活性剤としてα-DDMを用い、より精密度の高い解析を目指す。この解析を通じて、系IIの構築過程における各サブユニットの組み込み順序および構築過程に関与するタンパク質の機能を明らかにしていく。
構築最初期の系II部分複合体には結合しているが、成熟型系IIには結合していないタンパク質約10種の機能未知タンパク質について、作出した欠失変異体等を用いて系II機能の解析を行い、それらの機能未知タンパク質が系II構築に果たしている役割を解明する。またMnクラスターの具体的な形成時期を決定する。
系II複合体の多くの構成サブユニットは、酸素発生型光合成生物の間でよく保存されているが、それぞれのアミノ酸配列には相異がある。別の種の相同遺伝子を導入した株を作成し、その影響を解析する。
得られた結果を総合して、系II複合体の構築過程を総合的に明らかにし、成果の発表を行う。
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| Causes of Carryover |
32,271円の次年度使用額が生じた。比較的少額であり、とくに大きな理由はない。
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| Expenditure Plan for Carryover Budget |
次年度予算と合わせ、研究遂行のための薬品等の消耗品の購入に充てる。
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