2017 Fiscal Year Research-status Report
幹細胞化における細胞運命転換を制御するCDKAの標的因子の探索
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15K07119
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| Research Institution | National Institute for Basic Biology |
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Principal Investigator |
石川 雅樹 基礎生物学研究所, 生物進化研究部門, 助教 (00586894)
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| Project Period (FY) |
2015-04-01 – 2019-03-31
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| Keywords | 幹細胞化 / CDKA / ヒメツリガネゴケ / 細胞周期 |
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| Outline of Annual Research Achievements |
ヒメツリガネゴケの細胞周期制御因子CDKAによる細胞運命転換の制御機構を明らかにするため、平成29年度では以下の実験を行った。
1. CDKA標的因子の探索：（1）野生型とcdka変異体の茎葉体の大量培養を行った後、切断葉を回収しリン酸化タンパク質の抽出を行った。（2）平成28年度までの解析結果に基づいて、CDKAの標的因子は、幹細胞化の過程でCDKAと結合することが考えられた。そこで、CDKA-Myc融合タンパク質を発現する形質転換体の切断葉からタンパク質を抽出し、Myc抗体を用いてCDKA-Myc複合体を回収した後、その沈降産物を質量分析装置で解析した。その結果、CDKA複合体に含まれていると考えられる複数の因子を同定することができた。その中には、エピジェネティック制御に関わっていると予想される因子も含まれていた。しかしながら、予想されるアミノ酸配列からCDKAの標的タンパク質である可能性が低いことが分かった。このことから、CDKAとその標的因子の結合は、かなり弱いことが考えられたため、タンパク質間の架橋を考慮した免疫沈降法の改良を開始した。
2. in vitroキナーゼアッセイ：生化学的にCDKAキナーゼ活性を高感度に検出するために、ラジオアイソトープを用いないin vitroキナーゼアッセイの改良に成功した。
3. CDKAキナーゼ活性を検出するバイオセンサーの開発：コンストラクトのリンカー配列の長さやアミノ酸配列の変更、ドメイン配列の順番を変えたコンストラクトを作成したが、幹細胞化過程でCDKAによってリン酸化されるタンパク質のアミノ酸配列を用いることが不可欠であることがわかったため、CDKA標的因子の探索に集中した。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
4: Progress in research has been delayed.
Reason
CDKA複合体の精製に成功したが、これまでの条件ではCDKAの標的となりうる因子が含まれない可能性が高いことが分かった。そのため、当初の予想に反しCDKAとその標的因子の結合はかなり弱いと考えられた。そこで、これまでの免疫沈降の条件を見直し、タンパク質同士の架橋方法などを改善することで、弱い結合でも検出できるインタラクトーム解析を行う必要性が生じた。
CDKA標的タンパク質を同定するためには、リン酸化タンパク質の解析に加えて、インタラクトーム解析が必要不可欠であると考え、タンパク質の抽出条件検討等に多くの時間を費やした。そのため、質量分析装置を用いたCDKA結合因子や切断葉から抽出したリン酸化タンパク質の解析に遅れが生じた。
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| Strategy for Future Research Activity |
平成29年度に引き続き、石川が研究全体を統括するとともに実験を進める。
1. CDKA標的タンパク質の同定： (1) 野生型、cdka変異体の切断葉から抽出したリン酸化タンパク質を質量分析装置で解析し、野生型のみでリン酸化されているタンパク質を探し出す。(2) タンパク質同士の架橋を改善することで、CDKA標的タンパク質がCDKA-Myc複合体に含まれるような条件を探し出した後、その複合体を質量分析装置で解析する。(3) (1)と(2)の実験から候補となるタンパク質がCDKAによってリン酸化されるか、平成29年度で確立したin vitroキナーゼアッセイを行い確認する。
2. CDKAバイオセンサーの開発：1-(3)の実験でCDKAによるリン酸化が確認された場合、そのタンパク質のCDKAによってリン酸化されるアミノ酸を含む20アミノ酸残基を、NanoLucを用いたCDKAバイオセンサーに組み込んだバイオセンサーを作製し、ヒメツリガネゴケの野生型、cdka遺伝子欠失株に導入し検証する。
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| Causes of Carryover |
（理由）CDKAとその標的タンパク質の結合が当初の想定よりも弱く、これまでに確立した免疫沈降の条件では、共沈降しないことが推察された。そこで、CDKAの標的タンパク質を同定するために、タンパク質同士の架橋など、さらなる条件検討を行い、CDKAに結合するタンパク質を同定する必要性が生じた。その条件検討に多くの時間を費やし、質量分析装置を用いたCDKA結合因子の解析、および、切断葉のリン酸化タンパク質の解析に遅れが生じ、次年度でその解析を行う必要性が生じたため。
（計画）CDKA標的タンパク質同定するための試薬、バイオセンサー開発、ヒメツリガネゴケ形質転換・維持のための分子生物学的実験用試薬購入費として使用する。
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