2016 Fiscal Year Research-status Report
陸上植物における葉緑体型ペプチドグリカン合成系遺伝子の進化に関する研究
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15K07130
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| Research Institution | Kumamoto University |
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Principal Investigator |
武智 克彰 熊本大学, 大学院先端科学研究部(理), 准教授 (70515501)
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| Co-Investigator(Kenkyū-buntansha) |
高野 博嘉 熊本大学, 大学院先端科学研究部(理), 教授 (70242104)
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| Project Period (FY) |
2015-04-01 – 2018-03-31
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| Keywords | ヒメツリガネゴケ / カラマツ / MurE遺伝子 / 遺伝子相補解析 / 裸子植物 |
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| Outline of Annual Research Achievements |
ヒメツリガネゴケゲノムには、細菌が持つペプチドグリカン（PG）合成系遺伝子の全てが保存され、PGは葉緑体分裂に関与するが、被子植物シロイヌナズナには４種類の遺伝子しか保存されていない。本研究ではその１つであるMurE遺伝子に注目した。ヒメツリガネゴケMurE（PpMurE）はPG合成におけるアミノ酸リガーゼとして機能するが、シロイヌナズナのMurE（AtMurE）は、色素体の転写装置であるPEP複合体に含まれ、遺伝子発現を調節する。それでは、葉緑体進化の過程で、PG合成に寄与していたMurEはいつ機能転換したのであろうか？本研究では、コケ植物と被子植物の間に位置する裸子植物カラマツとオウシュウトウヒについて着目した。オウシュウトウヒはゲノムが公開されており、PG合成系遺伝子群を全てもっていた。遺伝子機能相補解析を行ったところ、カラマツMurE（LgMurE）をAtMurEタグラインに導入すると、葉緑体の異常形態が相補されたが、PpMurEを導入しても相補されなかった。またPpMurE KOラインに、AtMurE、LgMurEを導入しても、巨大葉緑体の形態は相補されなかった。一方、AtMurE、LgMurEには細菌MurEやPpMurEにはないN末端に機能未知のドメインが存在する。LgMurEのN末端ドメインにPpMurEのMurEドメインを融合させた遺伝子を、ヒメツリガネゴケに導入したところ、表現型が相補された。裸子植物のゲノムには全PG合成系遺伝子が存在しているのにも関わらず、LgMurEはPGを合成するヒメツリガネゴケで機能せず、シロイヌナズナで機能するという結果を得た。
またヒメツリガネゴケには、AtMurEやLgMurEに類似したN末端に機能未知ドメインを持つPpMurE2が保存されていることを示した。PpMurE2を遺伝子破壊しても、異常な表現型は観察されていない。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.
Reason
H28年度は、カラマツMurE（LgMurE）の局在解析並びに、ヒメツリガネゴケMurE（PpMurE）KOラインを用いた遺伝子相補解析を行った。GFP融合遺伝子を用いたLgMurEの局在解析については、葉緑体移行シグナルをGFPに融合させると、葉緑体に局在化することが示されたが、全長LgMurEと融合させると、葉緑体局在は観察されなかった。このため、現在、Mycタグ融合LgMurE導入形質転換体を作製し、免疫抗体染色により局在解析を行おうとしている。遺伝子相補解析については、LgMurEはPpMurEの機能を相補せず、AtMurEやLgMurEに存在するN末端の機能未知ドメインを除いた遺伝子を導入しても、相補は見られなかった。またAtMurEやLgMurEに存在するN末端の機能未知ドメインにPpMurEのMurEドメインを付加した遺伝子を導入すると相補が観察されたことから、MurEドメインに変異が入ることにより、MurEの機能分化が生じたものと推測された。本来の予定であれば、コケ植物と裸子植物の間に位置するシダ植物イヌカタヒバのMurEや、またシロイヌナズナがもつ別のPG合成系相同遺伝子であるDdlについても解析を行う予定であったが、局在解析と遺伝子組換え植物の作製に時間が掛かってしまったことから、進めることができなかった。
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| Strategy for Future Research Activity |
今年度は、AtMurEタグラインを用いて、PpMurE1、PpMurE2、LgMurE、AtMurEのドメインスワッピングによる遺伝子機能相補解析を行う。PpMurE2は葉緑体局在が確認されたが、KOラインにおいても表現型が観察されていない。PpMurE2はAtMurEに類似したN末端機能未知ドメインをもつため、PpMurE2をAtMurEタグラインに導入した遺伝子組換え植物を作製し、異常葉緑体表現型が相補されるか解析する。また同様に、AtMurE、LgMurEのN末端機能未知ドメインにPpMurE1またはPpMurE2 MurEドメインを融合した遺伝子を作成し、遺伝子組換え体の表現型から機能相補性検定を行い、N末端機能未知ドメインが色素体遺伝子発現に重要なのか、それともC末端のMurEドメインが重要なのかを明らかにしていく。さらにMurEのPG合成能には、C末端側のMurEドメインが重要であることが判明したので、アライメント解析や細菌MurEにおけるX線結晶解析の結果から、PG合成に重要なアミノ酸を推測し、MurEドメインをさらに細分化しPpMurE1とPpMurE2の間でスワッピングした変異体や、PG合成機能に重要と推測されるアミノ酸に変異を加えたPpMurE点突然変異体の作成を通じて、機能解析を行うことにより、MurEの遺伝子進化について明らかにしていく。
また時間が許すようであれば、MurEと同様にDdlについても、同様な解析を進めていく。またClick反応による蛍光標識法による葉緑体PGの可視化については、現在、車軸藻綱のクレブソルミディウム、コケ植物苔類ゼニゴケで試みており、加えて裸子植物カラマツにおいても試みる予定である。
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