2015 Fiscal Year Research-status Report
消化管上皮幹細胞の系譜解析とニッチ形成機構解明のための培養系の開発
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15K07136
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| Research Institution | Nippon Medical School |
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Principal Investigator |
岡 敦子 日本医科大学, 医学部, 教授 (50175254)
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| Project Period (FY) |
2015-04-01 – 2018-03-31
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| Keywords | 小腸 / 幹細胞 / Ror2 / Wntシグナル経路 / 甲状腺ホルモン / 変態 / 培養 / アフリカツメガエル |
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| Outline of Annual Research Achievements |
両生類の小腸では、変態期に上昇する甲状腺ホルモン（TH）により幼生上皮の一部（予定幹細胞）が成体幹細胞へと脱分化する。本研究は、アフリカツメガエルの予定幹細胞特異的に発現するRor2を指標にし、成体幹細胞の発生やそのニッチ形成機構を解明することを目指している。
本年度は、予定幹細胞の系譜を追跡していくため、Ror2のプロモーター領域にレポーター遺伝子をドライブさせたDNAコンストラクトを導入したトランスジェニック（Tg）カエルを作製した。現在、このTgカエルの幼生を使い、小腸でのレポーター遺伝子の発現解析を進めている。
この他に、TH応答遺伝子の発現解析により、幹細胞への脱分化時には Wnt5a/Ror2経路が活性化されるだけでなく、canonical Wnt経路も活性化され、幹細胞ではその出現と同時にbeta-cateninが核へと移行することを見出した。さらに、ツメガエル小腸の培養実験により、Wntリガンドに結合することが知られている secreted frizzle-related protein 2 が、Wnt5a/Ror2経路とcanonical Wnt経路の両方を促進し、幹細胞の発生に必須なタンパク質の１つであることを示す知見を得た。
また、幹細胞ニッチの形成機構を解析していくため、THにより予定幹細胞を幹細胞へと誘導する培養系の開発にも着手した。Ror2タンパク質は膜に局在するため、Ror2を発現する予定幹細胞のみを、抗Ror2抗体をまぶしたビーズに吸着させることが可能である。そこで、変態前の小腸上皮を結合組織から切り離し、この方法で予定幹細胞とそれ以外の上皮細胞（幼生固有細胞）を完全に分離できるか、現在解析を進めている。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
3: Progress in research has been slightly delayed.
Reason
当初、実験に使ったTgカエルでは、Ror2のプロモーター領域にドライブさせたレポーター遺伝子の発現が弱かったため、Tgカエルを作製し直すことになった。長いRor2のプロモーター領域を短くする等、導入するDNAコンストラクトを工夫し、新たにTgカエルを作製した。このTgカエルを使ってレポーター遺伝子の発現解析を進めているが、現時点では当初の計画に比べやや遅れ気味である。
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| Strategy for Future Research Activity |
現在、Ror2のプロモーター領域を含むコンストラクト作製の問題はほぼ解決し、Cre/loxP導入Tgカエルのライン化も順調に進んでいるので、今後は予定通り研究を遂行できると考えている。
Cre/loxP導入Tgカエルに、Ror2のプロモーター領域にCreをドライブさせたコンストラクトを導入してダブルTgカエルを作製する。このダブルTgカエルを使って予定幹細胞の系譜解析を進め、どの発生段階でRor2発現細胞の運命が幹細胞へと決定されるのかを明らかにする予定である。さらに、運命決定後のRor2発現細胞（予定幹細胞）を組織細胞化学的に解析し、その分子細胞学的特徴を明らかにする。
また、Tgカエルの小腸を使い、予定幹細胞を幹細胞へと誘導する培養系の開発も進める。予定幹細胞と幼生固有細胞を完全に分離した後、各細胞を結合組織と再結合させ、各培養片でのRNA-seq解析を行う。解析結果を比較することにより、ニッチ形成に関わる候補遺伝子（またはRNA）をスクリーニングし、さらにそれらの機能解析を進めていく予定である。
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| Remarks |
日本医科大学知的財産推進センター
http://tlo.nms.ac.jp/researcher/762.html
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