2015 Fiscal Year Research-status Report
ペプチド作動性チャネルの細胞外ドメイン内空間がチャネル機能に及ぼす影響
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15K07149
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| Research Institution | Hiroshima University |
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Principal Investigator |
古川 康雄 広島大学, 総合科学研究科, 教授 (40209169)
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| Project Period (FY) |
2015-04-01 – 2018-03-31
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| Keywords | イオンチャネル / ペプチド / FMRFamide |
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| Outline of Annual Research Achievements |
本研究は、神経系に発現するリガンド作動性チャネルの中で、進化的に特異な位置を占めるペプチド作動性チャネルの構造と機能を解明するために、チャネルの細胞外ドメイン内に存在する空間がチャネルのゲート機構とイオン透過性におよぼす影響を明かにすることを目的としている。
平成27年度は、軟体動物アメフラシのFMRFamide作動性Na+チャネル（AkFaNaC）の細胞外ドメイン内空間の底部に存在する552位、および556位のアスパラギン酸が作る陰性リング構造がチャネル機能におよぼす影響を詳細に検討するために、552位、556位変異体チャネル、および両者の二重変異体チャネルの機能とそのCa2+依存性を詳細に解析した。その結果、野性型チャネルは細胞外Ca2+により阻害されるが、その阻害曲線には３つの成分が認められ、552、556位のどちらのアスパラギン酸の負電荷を取り除いた場合でも、低濃度側の２つの成分が消失することがわかった。552、556位変異体においても1mM以上の高濃度Ca2+により阻害される成分は野性型と変わらなかったので、高濃度Ca2+による阻害部位は別に存在しており、おそらくチャネルフィルター近傍であろうと予想された。また、チャネルの活性化や脱感作の解析から、552、556位のアスパラギン酸の負電荷は、細胞外Ca2+と相互作用することでチャネル機能を制御する部位となっていることが明らかになった。現在、これらの成果を論文にまとめるために準備を進めている。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.
Reason
平成27年度の研究計画としてあげていたアメフラシのペプチド作動性チャネル（AkFaNaC）の556位変異体の機能解析、並びに552位と556位の二重変異体の機能解析は順調に進んでおり、平成27年度の成果とこれまでに得られた研究成果をもとにして、学術論文の作成に着手している。
機能解析実験が順調に進んでデータが蓄積した結果、その整理と解析に多くの研究時間を費やしたため、当初予定していたマイマイのFaNaCにおける変異体作製とヒドラのペプチド作動性チャネルのクローニングは遅れている。
しかしながら、前述のように、主たる解析を進めているチャネルであるAkFaNaCの機能解析実験の成果を論文作製に着手できる段階にまで進めることが出来ており、研究全体としてはおおむね順調であるといえる。
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| Strategy for Future Research Activity |
まず、現在、着手しているアメフラシのペプチド作動性チャネル（AkFaNaC）の552位、556位の変異体チャネルを用いた陰性リング構造の機能解析についてまとめた論文を完成させる。次に、マイマイのFMRFamide作動性チャネル（HaFaNaC）において、AkFaNaCの552,556位と相同な部位に点変異ならびに二重変異を導入した変異体チャネルを作製して機能解析実験を行い、これらの陰性リング構造がペプチド作動性チャネルの機能におよぼす共通性について検証する。さらに、PCR法によりヒドラのペプチド作動性チャネル（HyNaC）のcDNAをクローニングし、このチャネルにおけるAkFaNaCの552,556位相同部位の機能解析を同様に進める。
また、ホモロジーモデリングによりFaNaCの細胞外ドメイン内空間構造を精査し、細胞外ドメイン内空間に露出するアミノ酸側鎖の見当づけを行う。特に電荷を持つアミノ酸や芳香環を持つアミノ酸に着目し、それらアミノ酸の点変異体チャネルを作製して機能解析を進めていく予定である。
なお、当初の研究計画には含めていなかったが、細胞外ドメイン構造がチャネル機能に及ぼす影響を解析するために、機能的な細胞外ドメイン構造を維持するのに必要と思われる7ヶ所のS-S結合を個別に切断する変異体チャネルの作製を計画している。
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