2016 Fiscal Year Research-status Report
酵素の局在化メカニズムの多様性：テトラヒメナとゾウリムシの明瞭な違い
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15K07151
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| Research Institution | Kochi University |
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Principal Investigator |
鈴木 知彦 高知大学, 教育研究部自然科学系理学部門, 教授 (60145109)
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| Project Period (FY) |
2015-04-01 – 2019-03-31
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| Keywords | 酵素の局在 / Paramecium / アルギニンキナーゼ |
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| Outline of Annual Research Achievements |
高度な生理機能の維持には，酵素の局在化が重要な役割を果たしている場合がある．この局在化が妨げられると酵素は本来の行き場を失う． 我々は，繊毛虫Tetrahymenaのアルギニンキナーゼ（AK1）が，N末端のミリストイル基を介して繊毛膜に局在していることを明らかにした．そして，繊毛運動においてAK1をキー酵素とする連続的なATP供給機構を提唱した．一方で，繊毛虫Parameciumでは事情が大きく異なる．後者のAKは，N末のミリストイル化シグナル配列を欠く．しかし代わりに，C末端に疎水性のプレニル基を結合させるシグナル配列を持っていた．つまり，両者は全く異なる方法でAK酵素を繊毛膜に局在させている可能性が高いのである．
今回の研究ではParameciumに存在する４種類のAKに焦点を当て，それらの細胞内での機能と局在メカニズムを明らかにする．
今年は，以下の進捗状況の欄に詳細が記載されているように，P. tetraurelia AK3に見出された基質阻害のメカニズムの解明，抗体検出による４種類のAKの細胞内局在，P. tetraurelia AK3と同様にプレニル化シグナル配列を持つオオウミシダ AKのプレニル化の証明実験を行った．
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.
Reason
１．P. tetraurelia AK3の基質阻害のメカニズムの解明：基質阻害は，基質濃度が高くなると酵素活性が低くなる現象を指し，一般的には活性部位に本来の基質結合部位とは異なる第２の基質結合部位が生じることによって引き起こされる．この現象は，整理機能と密接に関わっている場合がある．４種類のAK酵素の中で，AK3にこの現象が見られた．AK３の基質結合に関わるGS領域のアミノ酸配列D-D-S-Q-V （77-81番目の残基）に変異を導入した６種類の変異体（D77A, D78A, S79A, Q80A, Q80S, and V81A）を作成して基質阻害メカニズムの解明を行なった．結果的に，S79A変異体において基質阻害の大部分が消失し，S79が基質阻害に関わっていることが証明された．野生型酵素であるAK3に，この基質阻害が見られる生理的意義について今後議論する必要がある．
２．AK1-4の細胞内局在：Paramecium AKの生体内局在を確かめるために、ポリクローナル抗体を使ったウエスタンブロットを行った．今回はAK2とAK3に対する二種類のポリクローナル抗体を作成した．Parameciumの生細胞全体，繊毛を除去した細胞，繊毛を単離し，上記二種の抗体を使ってウエスタンブロットによりAK2，AK3の局在を確認した．しかしながら，ウエスタンブロットの結果からは，局在に関する明瞭な情報は得られなかった．しかし，繊毛と細胞ではAKの発現量が大きく異なっていることが分かった．
３．オオウミシダ AK1のプレニル化の解明：オオウミシダのAK1はC末端側に明瞭なプレニル化シグナル配列を持つ．AK1を無細胞タンパク質合成系を用いて合成した．それをトリプシンで消化し，マススペクトル分析を行った（外注）．その結果，C末端のトリプシンペプチドがゲラニルゲラニル化されていることが明らかとなった．
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| Strategy for Future Research Activity |
これまでの研究から，Paramecium AK3がプレニル化され，主に繊毛に局在している可能性が高いことが明らかになった．
今後はParameciumにおけるAK酵素の生理的意義に重点を置いた研究を行う．具体的には，基質阻害を持つAK3酵素の存在意義や，食餌法によるRNAiを用いたAK酵素の機能阻害実験などを予定している．
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| Causes of Carryover |
ペプチドマスフィンガープリンティング（PMF）分析を，外注から学内分析に変更することで解析費用を節約できたが，学内機器では検出感度が低いために再分析が必要な状況であることがわかった．このため，無細胞タンパク質合成キットの購入やPMF分析の支払いにより今後予算執行が速やかに行われる予定である．
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| Expenditure Plan for Carryover Budget |
本年度後半に，ペプチドマスフィンガープリンティング（PMF）の再分析を外注により行う予定であり，そのために必要な無細胞タンパク質合成キットの購入や関連消耗品等の購入，PMF分析の支払い等に予算を適切に使用する予定である．
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