2018 Fiscal Year Annual Research Report
Construction of the new method for amino acid racemase screening using amino acid auxotrophic E. coli
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15K07152
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| Research Institution | Kochi University |
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Principal Investigator |
宇田 幸司 高知大学, 教育研究部自然科学系理工学部門, 講師 (10448392)
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| Project Period (FY) |
2015-04-01 – 2019-03-31
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| Keywords | アミノ酸ラセマーゼ |
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| Outline of Annual Research Achievements |
本研究は，動物に存在する新規アミノ酸ラセマーゼの探索とその機能解析を目的として行っている。近年，多くの動物でD型のアミノ酸が発見され，その生理機能の報告も多くなされている。しかし，生体内でD-アミノ酸の合成を行うとされているアミノ酸ラセマーゼは限られた動物でしか発見されていなかった。本研究では，前年度までに，多数の動物から新規アミノ酸ラセマーゼ遺伝子の単離を行い，そのリコンビナント酵素の発現系の構築を行ってきた。
本年度は，前年度までに申請者によって遺伝子が単離され，そのリコンビナント酵素発現系が確立された多数のアミノ酸ラセマーゼ候補遺伝子についての酵素学的研究を進めた。大腸菌によって発現されたリコンビナント酵素をアフィニティクロマトグラフィーによって精製し，各種アミノ酸に対するアミノ酸ラセマーゼ活性及び，デヒドラターゼ活性の有無について確認した。その結果，単離したアミノ酸ラセマーゼ候補遺伝子のほぼ全てにおいて，セリンラセマーゼ活性，セリンデヒドラターゼ活性，アスパラギン酸ラセマーゼ活性，またはグルタミン酸ラセマーゼ活性等が確認された。さらにラセマーゼ活性，又はデヒドラターゼ活性の確認されたアミノ酸基質については，基質濃度を変化させて反応速度を測定することで，これらのアミノ酸ラセマーゼの各種基質に対するKm値及びkcat値の決定を行った。また，新たに発見されたアミノ酸ラセマーゼのうち幾つかについては，アミノ酸配列からその立体構造予測を行い，基質結合部位の推定を行った。さらに，推定された基質結合部位周辺のアミノ酸残基に対する置換変異体酵素の作製を行った。作製されたアミノ酸置換変異体酵素については，野生型酵素との酵素機能の違いを詳細に検討し，アミノ酸ラセマーゼにおける基質結合部位の特定を進めた。
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Research Products
(4 results)
