2015 Fiscal Year Research-status Report
体内受精様式の成立に関わる輸卵管の機能進化の実証的研究
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15K07165
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| Research Institution | Yamagata University |
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Principal Investigator |
渡辺 絵理子 山形大学, 基盤教育院, 准教授 (20337405)
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| Co-Investigator(Kenkyū-buntansha) |
渡邉 明彦 山形大学, 理学部, 教授 (30250913)
越智 陽城 山形大学, 医学部, 准教授 (00505787)
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| Project Period (FY) |
2015-10-21 – 2018-03-31
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| Keywords | 精子運動開始因子 |
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| Outline of Annual Research Achievements |
１、SMIS遺伝子ノックアウトアカハライモリの作成
CRISPER/CAS9を用いた、精子運動開始因子SMIS（Sperm Motility-Initiating Substance）遺伝子ノックアウト（KO）アカハライモリを効率よく作成するための実験系の確立を目的とし、sgRNAの配列の検討、および変異体のスクリーニング法の検討を行った。SMIS遺伝子の既知の配列をもとに、開始コドン近傍および機能部位を標的とした8種類のsgRNAを設計し、合成したsgRNAをCas9タンパク質とともにアカハライモリ受精卵に注入した。注入後の受精卵は神経胚まで発生させた後にゲノムDNAを抽出し、HMAにより標的配列における塩基の変異の検出を行った。HMAにより変異体と推定される個体についてはDNAシークエンス解析を用いて最終的な評価を行った。その結果、これまでにSMIS遺伝子中の標的配列に変異を引き起こすと考えられるsgRNAが確認された。これにより、28年春期採集イモリの卵を用いて、SMIS遺伝子に変異が導入された個体を作成することが可能となった。
２、モリアオガエルSMIS相同遺伝子の同定
研究費の交付内定が10月であったため、繁殖期のモリアオガエルの輸卵管からRNAを得ることがかなわず、凍結保存したRNAを用いたRNAseqを行った。現在de novo アセンブリを行っており、このRNAseqデータよりモリアオガエルSMIS相同遺伝子を同定することができれば、SMIS遺伝子KOモリアオガエルの作成を行うことが可能となる。また、今回使用したRNAは必ずしもSMIS相同遺伝子同定に最適な条件の輸卵管より抽出したものではないため、現在のデータの解析と平行して28年春の繁殖期のモリアオガエルを採集、輸卵管よりRNAを抽出しRNAseqを行う。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
3: Progress in research has been slightly delayed.
Reason
研究費の交付内定が10月であったため、繁殖期のモリアオガエルの輸卵管から抽出したRNAを用いたRNAseqを行うことがかなわなかった。代替としてこれまでに輸卵管より抽出し、凍結保存していたRNAを用いてRNAseqデータを作成中であるが、このRNA抽出に用いた輸卵管の条件はSMIS相同遺伝子同定には最適なものではないと考えられる。そのため、平行して、当初27年度に計画していた繁殖期のモリアオガエル輸卵管より抽出したRNAを用いたRNAseqを1年繰り越して、28年度に行うこととする。
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| Strategy for Future Research Activity |
１、SMIS遺伝子KOアカハライモリの作成
SMIS遺伝子標的配列に変異を引き起こすことが確認されたsgRNAを用いて、変異個体を作成、飼育する。sgRNAとCAS9タンパク質を注入した受精卵は幼生まで飼育し、切断に耐えうるステージに達した後に幼生の尾を切断、ゲノムDNAを抽出し、HMAによりセレクションを行う。ゲノムの変異が想定される個体を集め、効率よく成熟させるための飼育を行う。成熟したSMIS遺伝子KO個体を用いて、SMISタンパク質を分泌する輸卵管部位およびSMISタンパク質が局在する卵ジェリー層の形態学的、免疫組織科学的解析を行う。さらにバイオアッセイとして、SMIS遺伝子KO個体の卵ジェリー層中およびSMIS遺伝子KO個体の卵を用いて作成したSMISタンパク質抽出液中における精子運動の変化を解析する。
２、モリアオガエルSMIS相同遺伝子の同定およびSMIS遺伝子KOモリアオガエルの作成
繁殖期のモリアオガエル輸卵管からRNAを抽出し、RNAseq行い、SMIS相同遺伝子を同定する。同定されたSMIS相同遺伝子の塩基配列の情報を用いてsgRNAを設計し、CRISPER/CAS9によりSMIS遺伝子KOモリアオガエルを作成し、形態学的、免疫組織化学的解析およびバイオアッセイを行う。
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| Causes of Carryover |
モリアオガエルSMIS相同遺伝子の同定を行うことを目的として、27年4~5月に繁殖期を迎えたモリアオガエルを採集、使用することを計画していたが、補助金交付決定が10月であったため、この計画を実行することができなかった。代替として、凍結保存したサンプルを用いて実験をすすめてはいるが、確実に結果を得るためには平行して4~5月採集の個体を使用した実験を行う必要がある。そのための予算を次年度使用とした。
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| Expenditure Plan for Carryover Budget |
繁殖期のモリアオガエル輸卵管からRNAを抽出し商業サービスを用いてRNAseqを行い、de novoアセンブリ、ヒトおよびマウスの遺伝子データベースを用いてアノテーションを行う。このRNAseqデータよりモリアオガエルSMIS相同遺伝子の同定を行う。
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Research Products
(1 results)
