深海熱水生態系の遺伝子水平伝播に関わる細胞外膜小胞の網羅的機能解析

2015 Fiscal Year Research-status Report

• Project/Area Number: 15K07206
• Research Institution: Japan Agency for Marine-Earth Science and Technology
• Principal Investigator: 吉田 ゆかり 国立研究開発法人海洋研究開発機構, 深海・地殻内生物圏研究分野, 技術主任 (10553216)
• Project Period (FY): 2015-04-01 – 2018-03-31
• Keywords: 深海熱水噴出域 / 細胞外膜小胞 / イプシロンプロテオバクテリア / 次世代シーケンス

Outline of Annual Research Achievements

細菌が恒常的に細胞外に分泌する細胞外膜小胞は、シグナル情報伝達などの細胞間コミュニケーションとしての機能だけでなく、遺伝情報物質の細胞間輸送にも関与しており、新たな遺伝子伝播因子としての可能性が注目されている。本研究の目的は、深海底熱水生態系を代表する生物モデルとして、多様なエネルギー代謝経路を持ち、ダイナミックな熱水環境に適応したイプシロンプロテオバクテリア鋼の化学合成独立栄養細菌を用いて、細胞外膜小胞に内包される遺伝情報の網羅的機能解析を行い、その生態学的・進化学的機能を詳細に把握することである。本年度は、まず、沖縄トラフに位置する深海底熱水活動域から採取したチムニーやバクテリアマットなどの様々な試料を用いて、分子系統レベルや代謝能が異なる多様なイプシロンプロテオバクテリアを単離した。単離菌株の培養液から細胞外膜小胞を分離・精製するため、密度勾配遠心剤としてOptiprepを用いた密度勾配遠心法の条件検討を行い、最適な密度を決定した。最適化した条件により、単離菌株の培養液から細胞外膜小胞画分を分離・精製し、ネガティブ染色後、電子顕微鏡下で観察した。各単離菌株の細胞外膜小胞の産生能の有無を調べた結果、株間で産生量に違いがあったものの、いずれの株においても細胞外膜小胞の存在が認められた。さらにその形状およびサイズを調べ、その形態学的特徴を明らかにした。単離菌株のうち一部の株についてゲノム解析を実施し、次年度以降の細胞外膜小胞内の遺伝情報解析に必要なドラフトゲノム配列を取得した。

Current Status of Research Progress

2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.

Reason

すでにイプシロンプロテオバクテリアの単離菌株が細胞外膜小胞を産生することを確認し、その精製も可能であることから、次年度以降の遺伝情報の網羅的機能解析も計画的に実行できる予定である。したがって、当初の計画通りに順調に進展していると考える。

Strategy for Future Research Activity

平成28年度は、細胞外膜小胞の産生量が多い株を代表株として、細胞外膜小胞に内包される遺伝情報の網羅的機能解析を行う。具体的には、精製した細胞外膜小胞からDNAを抽出し、次世代シーケンサーを用いてシーケンスを行い、得られた配列データから各遺伝子の含有量を定量化する。また、増殖段階や培養条件によって、細胞外膜小胞の産生量や内包される遺伝情報が変化するかを調べる。

Causes of Carryover

当初の計画よりも消耗品の使用量を多少軽減できたため。
また国外でのサンプリング予定が国内へ変更となり旅費が抑えられたため。

Expenditure Plan for Carryover Budget

次年度のシーケンシング試薬購入に充てる予定である。