ゲノム編集を用いた半数体作出法の開発

2015 Fiscal Year Research-status Report

• Project/Area Number: 15K07256
• Research Institution: Okayama University
• Principal Investigator: 長岐 清孝 岡山大学, その他部局等, 准教授 (70305481)
• Project Period (FY): 2015-04-01 – 2018-03-31
• Keywords: 半数体 / 動原体

Outline of Annual Research Achievements

本研究の目的：本研究では、「簡便で汎用性のある半数体作出法の確立」を目的とする。「半数体作出とその倍加」による「半数体育種法」は、純系を得る為の時間を大幅に短縮することができる。しかし、これまで半数体は花粉培養や異種交配により作出され、これらの方法を利用できる種はごく僅かであった。そこで、本研究では真核生物に普遍的に存在する動原体タンパク質および動原体DNAをゲノム編集により改変して、その機能を低下させる。続いて、この機能低下した動原体をもつ配偶子と正常な動原体をもつ配偶子を交配することにより、受精胚中で選択的に片親由来の染色体セットを脱落させ、半数体を効率的に作出する。
本年度実施した研究およびその成果：
（１）動原体機能低下系統の作出：各植物分類群の代表であるイネ、シロイヌナズナ、トマトおよびミヤコグサにGFPを融合したCENH3を導入するとともに、内在性CENH3遺伝子のゲノム編集によるノックアウトを試みた結果、シロイヌナズナおよびトマトにおいてGFP融合CENH3と内在性CENH3破壊用TALENコンストラクトをもつ系統を得た。これらの系統の後代から内在性CENH3がノックアウトされている個体のPCRおよびシーケンスによる選抜を行っているが、現在のところノックアウト変異をもつ個体は選抜できていない。
（２）無動原体花粉形成系統の作出：シロイヌナズナにおいて、動原体配列を標的としたTALENにより花粉中の動原体DNA配列をゲノム編集による除去を試みた。TALENコンストラクトをもつ系統の後代の核型を確認したが、現在のところ動原体配列が有為に減少した系統および動原体領域で染色体切断が起きている系統は得られていない。
現在、上記の選抜と平行してTALEN法よりも高効率なゲノム編集が可能なmultiplex CRISPR/Cas9コンストラクトにより、上記系統の作出を試みている。

Current Status of Research Progress

3: Progress in research has been slightly delayed.

Reason

どの種においてもTALENによる内在性CENH3破壊株が得られていない。また、TALENにより動原体配列が削除された系統も得られていない。これらの原因としてTALENの効率が低いことが考えられるので、現在、TALENよりも高効率にゲノム編集が可能なmultiplex CRISPR/Cas9コンストラクトを作成し、植物体への形質転換を順次行っている。multiplex CRISPR/Cas9により高効率にゲノム編集が可能な個体が平成28年度の早い時期に得られれば、当初の計画通りに研究が遂行できるので「やや遅れている」と自己評価した。

Strategy for Future Research Activity

今後は、multiplex CRISPR/Cas9による内在性CENH3ノックアウト系統および無動原体花粉形成系統の作出を進めるとともに、他の動原体タンパク質についても同法によりノックアウト系統の作出を行い、これらを用いた半数体の作出を試みる。また、最近、CENH3の動原体局在能の低下した系統でも半数体が生じることが報告されたので、CENP-C結合領域を欠くCENH3を大量発現させ、動原体内での内在性のCENH3の割合を低下させることによる動原体機能低下系統の作出も試みる。

Causes of Carryover

基金は繰り越しが可能なので、小額を繰り越した。

Expenditure Plan for Carryover Budget

繰越額は少額なので、使用計画に変更は無い。