2016 Fiscal Year Research-status Report
植物免疫におけるRNAサイレンシング機構のプライミング
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15K07307
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| Research Institution | Tohoku University |
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Principal Investigator |
安藤 杉尋 東北大学, 農学研究科, 准教授 (10442831)
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| Project Period (FY) |
2015-04-01 – 2018-03-31
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| Keywords | miRNA / サイレンシング / プライミング / ウイルス / 植物免疫 |
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| Outline of Annual Research Achievements |
昨年度までに、BTH処理によるプライミング誘導時にmiRNA(miR403およびmiR168)が蓄積することや、miRNA産生変異体であるhyl1-2においてAGO2が恒常的なプライミングすることやCMV抵抗性が亢進することを示し、miRNAがAGO2のプライミングに関与していることを示唆した。
本年度はさらに、miRNA産生変異体hst15とmiRNAを取り込みRNAの分解に関わるAGO1の変異体ago1-45をもちいて解析を行った。その結果、hyl1-2と類似の結果が得られたことから、miRNAのプライミングへの関与がさらに強く支持された。そこで、miR403のターゲット配列を欠失したAGO2ゲノム配列を（プロモーター約2kbとターミネーター約500bpを含む）をago2-1変異体に形質転換し、AGO2のプライミングについて解析を行った。その結果、AGO2のBasalな発現が野生型や、コントロールとして野生型のAGO2ゲノム配列を形質転換した系統と比較して上昇するが、BTH処理によるプライミングを示す発現パターンは維持された。従って、miR403はAGO2のBasal levelの制御に機能していることが示唆された。
一方、AGO2プロモーターへのRNAポリメラーゼのaccessibilityの解析ではプロモーター領域のRNAPII（CTD-Ser5P）量がBTH処理によって減少することが示唆され、プロモーター領域のクロマチン密度やヒストン修飾の変化がRNAPIIの結合に影響している可能性が考えられた。
ヒストン修飾関連の変異体についてもヒストン脱メチル化酵素（LDL1, LDL2, LDL3)の変異体を入手し、CMV抵抗性の解析を行ったが野生株と変化が認められなかったため、交配により、多重変異体の作成を行った。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
3: Progress in research has been slightly delayed.
Reason
現在までにmiRNAがAGO2のプライミングやCMV抵抗性に関与することが示唆された。また、AGO2のmiRNAターゲットサイトを欠失させた遺伝子導入形質転換体を作出したことで、miRNAのAGO2発現制御について直接的に解析ができるようになった。一方、プロモーター領域のクロマチン構造の解析では、具体的に転写機構がプライミング時にどのように制御されているのかを示唆する結果が得られてきている。
ヒストン修飾関連の変異体についてもメチル化酵素ATX遺伝子5個の多重変異体を作成中で、現在までに4重変異体を得ている。脱メチル化変異体はldl1, ldl2, ldl3の3重変異体を作成済みであり、解析を始めているところである。
プライミング時のmiRNAの動態を把握するため、miRNA-seqを計画していたが、現在までに行えていない点で遅れが生じている。しかしながら、研究室にMiSeqが導入されたことで、行う環境が整い、次年度には行う予定である。
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| Strategy for Future Research Activity |
現在進行中の実験を継続して行う。また、研究計画に従い以下の項目について解析を行う。
①miRNA-Seqによってプライミング時に発現変動するmiRNAを把握する。
②変動が認められたmiRNA遺伝子のプロモーター領域のクロマチン構造の解析
③変動が認められたmiRNAのターゲット遺伝子の変異体の解析
④ヒストン修飾関連変異体を用いたプライミングの変化、クロマチン構造の解析、CMV抵抗性の解析を行う。
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| Causes of Carryover |
本年度までに計画していたmiRNA-Seqによる解析が予定より遅れているため、執行せずに繰り越された金額が存在する。当初、受託解析依頼する予定であったが、平成28年度に次世代シークエンサーMiseqが研究室に導入されたことから、平成29年度にこれを用いて行う予定である。
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| Expenditure Plan for Carryover Budget |
次世代シークエンサー関連の消耗品の購入に充てる予定である。繰越額が大きいが、これら消耗品は高額なものが多いため、適正に執行が可能であると考えている。
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