2015 Fiscal Year Research-status Report
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15K07352
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| Research Institution | The University of Tokyo |
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Principal Investigator |
依田 幸司 東京大学, 農学生命科学研究科, 名誉教授 (20143406)
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| Co-Investigator(Kenkyū-buntansha) |
野田 陽一 東京大学, 農学生命科学研究科, 助教 (90282699)
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| Project Period (FY) |
2015-04-01 – 2018-03-31
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| Keywords | 微生物 / 酵母細胞壁 |
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| Outline of Annual Research Achievements |
出芽酵母細胞壁β-1,6-glucanの生合成に中心的役割を果たすと強く予想されるKre5, Kre6蛋白質に関し以下の解析を行った．UGGT（UDP-glucose:glycoprotein glucosyltransferase） の酵母相同蛋白質であるKre5にHis-tagを付加し，昆虫細胞Sf9を用いて分泌発現して，培地から Ni-NTA columnにより精製した．コントロールとして，分裂酵母のKre5相同蛋白質Gpt1も，同じく分泌生産して精製した．精製したKre5と，地衣類から得られ，β-1,6-glucanを主成分とするpustulanから調製した短いβ-1,6-glucan鎖をPA標識したものを基質としたin vitro反応系を構築し，β-1,6-glucanの生合成への関与を解析した．その結果，予備的ではあるが，Kre5の存在に依存する反応が検出された．また酵母の細胞抽出液中にβ-1,6-glucanを切断する活性を見出した．細胞破砕液から界面活性剤により抽出した画分を加熱処理して不溶化した画分を遠心で除き，その上清を異なるpHの移動層を用いた二回の連続したDEADカラムを用いた分離により，精製を進めた．またII型膜貫通型蛋白質であるKre6に関しては，N糖鎖付加部位など機能に関与すると予想される配列にアミノ酸置換を導入し，機能や細胞内分布への影響を調べた．KRE6遺伝子は生育に必須ではないが，相同蛋白質をコードするSKN1遺伝子との二重破壊は致死となる．このことを利用して，Δkre6 Δskn1株において，アミノ酸置換を行ったKre6蛋白質を発現するように遺伝学的な操作を行い，その生死により，Kre6のアミノ酸置換体の機能を調べた．その結果，置換により機能を完全に失うようなアミノ酸残基，また修飾や蛋白量に影響を及ぼすアミノ酸残基が同定された．
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.
Reason
計画していたプラスミドや変異体の構築や組換え蛋白質の生産精製は，ほぼ予定通りに達成することができ，in vitro系の構築も行うことができた．これを踏まえて，次年度以降の研究の目途が立った.
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| Strategy for Future Research Activity |
発現精製に問題の多かったKre6の高発現，精製を，条件検討の幅をさらに広げて成功させる．得られたKre6を用いてin vitroの反応系を作り，機能を解析する．
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