2017 Fiscal Year Annual Research Report
Comprehensive study on the mechanism of fungal cell-wall glucan synthesis
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15K07352
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| Research Institution | The University of Tokyo |
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Principal Investigator |
依田 幸司 東京大学, 大学院農学生命科学研究科(農学部), 名誉教授 (20143406)
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| Co-Investigator(Kenkyū-buntansha) |
野田 陽一 東京大学, 大学院農学生命科学研究科(農学部), 助教 (90282699)
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| Project Period (FY) |
2015-04-01 – 2018-03-31
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| Keywords | 微生物 / 酵母細胞壁 |
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| Outline of Annual Research Achievements |
β-1,6-glucanの合成に関わる３つのKre蛋白質，Kre5, Kre6, Kre9の個々の機能を明らかにするために，またin vitro系実験等の基盤となる知見を得るために以下の実験を行った．Kre5とKre6の相互作用の有無を免疫沈降実験により検討した．最初に野生株を用いて共免疫実験を行ったところ，非常に弱い共沈降のシグナルが得られた．β-1,6-glucan合成の変異株を含めた，細胞壁に異常を示す変異株で同じ実験を行ったところ，一群の変異株において，強いKre5とKre6の共免疫沈降のシグナルが得られた．Kre9は自身のプロモーターにより発現するとおそらくO糖鎖の付加の程度の差異により，SDS-PAGE上で数本のブロードなシグナルとして検出される．高発現するとさらにバンドのパターンは複雑になる．それらがどのような分子種なのか，また他のKre蛋白質の機能との関連を調べるために，やはり細胞壁に異常を示す変異体での高発現を行った．その結果，一群の変異株で，幾つかのバンドの消失が見られた．高発現したKre9の種々の酵素による処理や，変異の導入により，その原因の解明を試みている．また前年度より引き続き行っている出芽酵母膜の活性，細胞質の切断活性に関しては，バンドの同定のため質量分析を行ったが，明らかに追求している活性の本体とは考えにくい，細胞内に量が多く存在するために混入したと考えられる蛋白質ばかりがヒットした．分離を大きく改善するために異なる分離モードを持つカラムを導入し，条件検討を行い，それぞれ一本～数本のバンドにまで精製度を高める方法を確立した．それらのバンドをゲルから抽出して，質量分析を行ったが，おそらくは量の不足のため，まだ同定には至っていない．現在スケールアップの方法を検討している．
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