2015 Fiscal Year Research-status Report
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15K07356
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| Research Institution | Shinshu University |
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Principal Investigator |
池田 正人 信州大学, 学術研究院農学系, 教授 (00377649)
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| Co-Investigator(Kenkyū-buntansha) |
竹野 誠記 信州大学, 学術研究院農学系, 准教授 (30422702)
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| Project Period (FY) |
2015-04-01 – 2018-03-31
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| Keywords | コリネバクテリウム グルタミクカム / ビオチン / ピメリン酸 / 脂肪酸 / BioI |
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| Outline of Annual Research Achievements |
【コリネ菌のビオチン要求性解除に必要なサプレッサー変異の特定】
コリネ菌に、大腸菌由来のbioFと枯草菌由来のbioI を導入するとビオチン要求性が解除された。しかし、その出現がサプレッサー様であることから、ビオチンのデノボ合成には何らかのサプレッサー変異の関与が示唆された。独立に得たビオチン非要求株4株について、全ゲノム解析を行った結果、異なるサプレッサー変異が見いだされた。それらは、メタロプロテアーゼ、リボヌクレアーゼE、分子シャペロンのミスセンス変異と、bioI の開始コドンGTG（レアコドン）をATG（標準コドン）に変える変異であった。bioI の開始コドン変異はBioIの反応促進をもたらすと考えられることから、他の変異も異なるメカニズムでBioI反応の向上に寄与している可能性がある。しかし、それら変異を代表一株へ集約しても、ビオチンバイタマー生産への有意な相加効果は確認できなかった。それら4遺伝子については増幅効果も調べたが、有意な増産効果が認められたのはbioIのみであった（数μg/Lから数十μg/Lへと約１０倍）。
【レドックスパートナー遺伝子の同時増強効果】
BioIはP450酵素のためレドックスパートナーが必要であるが、枯草菌のBioI とコリネ菌のレドックスパートナーの相性が悪い可能性がある。従って、同酵素の本来のレドックスパートナー候補（fer、ykuN、ytbQ）を枯草菌からクローン化し、bioI との共発現効果を検討した。併せて、コリネ菌自前の3種のレドックスパートナー遺伝子（fdxA、fdxB、fdxC）についても検討した。その結果、枯草菌のferおよび自前のfdxAにビオチンバイタマー増産効果が認められた。しかし、効果が1.3倍程度と顕著ではないことから、現時点ではBioIへの電子の供給は大きな律速にはなっていないと判断された。実際、bioIのみを強力プロモーター下で高発現させると、ビオチンバイタマー力価は更に数倍に向上した（数百μg/Lレベル）。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.
Reason
当初の研究実施計画では以下の3点を掲げた。2番目の項目は、状況に鑑みてペンディングとしたが、その他の項目は計画通りに実施して、今後の課題と方向性を明確にできたと判断できるため。
１．コリネ菌のビオチン要求性解除に必要なサプレッサー変異の特定
２．同サプレッサー変異を有する遺伝子の機能解析
３．BioI反応に必要なレドックスパートナー遺伝子の同時増幅効果
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| Strategy for Future Research Activity |
【コリネ菌によるピメリン酸の分泌生産】
BioI反応の律速を解除する方法が見つかれば、これをコリネ菌のオレイン酸生産株に適用することで、オレイン酸に至るカーボンを少なくともピメリン酸チオエステル（Pimeloyl-CoA）まで導くことができるはずである。ピメリン酸チオエステル下流のBioFで代謝を遮断して、そのカーボンを遊離ピメリン酸として分泌させられるかどうかを検討する。
【簡便なピメリン酸バイオアッセイ系の開発】
コリネ菌野生株に大腸菌のbioF を導入すると、ビオチンの要求性がピメリン酸で代替される。この性質を利用して、ピメリン酸のバイオアッセイ系を開発する。このピメリン酸要求株を指示菌とするためには、さらに、同株の生育がオレイン酸やビオチンに反応しないようにする必要がある。我々は既に、ホスホエノールピルビン酸カルボキシラーゼを遮断するとオレイン酸に反応しないようにできること、一方、ビオチン取り込み系遺伝子bioYを破壊するとビオチンに対する感度を3桁下げられることを見出しているので、これらの知見を応用する。
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| Remarks |
http://soar-rd.shinshu-u.ac.jp/profile/ja.uhLNPUkh.html?lng=ja&id=uhLNPUkh
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