2015 Fiscal Year Research-status Report
大腸菌のスペルミジン異化経路の解明～バイオフィルム制御とポリアミン生産に向けて
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15K07357
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| Research Institution | Kyoto Institute of Technology |
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Principal Investigator |
鈴木 秀之 京都工芸繊維大学, 応用生物学系, 教授 (10202136)
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| Project Period (FY) |
2015-04-01 – 2018-03-31
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| Keywords | ポリアミン / プトレッシン / アセチルスペルミジンオキシダーゼ / スペルミジン |
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| Outline of Annual Research Achievements |
アルギニンからプトレッシンを生合成するのに必要な酵素をコードする遺伝子speABを欠失、さらにオルニチンからプトレッシンを生合成するのに必要な酵素をコードする遺伝子speC, speFを欠失することにより、プトレッシンを生合成できなくなったMR37株を研究室で作成していた。そこで、γ-グルタミルプトレッシンを経由してプトレッシンを異化するPuu代謝系の最初のステップを触媒する酵素（γ-グルタミルプトレッシン合成酵素）をコードするpuuA遺伝子とプトレッシンのアミノ基をα-ケトグルタル酸に転移することによって代謝するアミノトランスフェラーゼ経路の最初のステップを触媒する酵素（プトレッシンアミノトランスフェラーゼ）をコードするpatA遺伝子を１つずつ、あるいは両方欠失した菌株を作出した。コロニーPCRにより、全ての欠失が計画通りに作成できたことを確認した。
スペルミジンをアセチル化することにより無力化するスペルミジンアセチルトランスフェラーゼをコードする遺伝子speGをプラスミド上にクローニングし、T5プロモーターから高発現できるようにした。
一方、スペルミジンを菌体外から取り込むトランスポーターとして報告されているPotABCDトランスポーターをコードするpotABCD遺伝子をpMW119とpBelobac上にクローニングした。こちらの方は、potABCD自身が持つプロモーターから発現するようにしている。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
3: Progress in research has been slightly delayed.
Reason
菌株作成に手間取っているためである。Datsenko & Wanner法による遺伝子の破壊は効率的であるが、変異の導入を重ねていくためには、FRT配列を利用して薬剤耐性マーカーを取り除く必要がある。その際、ゲノムのあちこちにFRTが挿入されていると異常な欠失が起こることがある。特に変異の数が増えていくと、この傾向が顕著である。
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| Strategy for Future Research Activity |
（１）大腸菌はアセチルスペルミシジンオキシダーゼを持つかどうかを判定する。 プトレッシンは生合成欠損株を高濃度のスペルミジンを添加し、かつプトレッシンを含まない培地で培養し、菌体内外のプトレッシンの有無を確認する。この菌株は作成済みである。
（２）（１）において、アセチルスペルミジンオキシダーゼがあると判断できた場合は、その遺伝子のクローニングを行う。
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| Causes of Carryover |
菌株の作成が遅れたため、菌株を培養し、菌体内外のポリアミン量を測定できていない。ポリアミン量測定の際に必要な、菌株の培養、サンプル調製、HPLCによる分析に必要な試薬や器具を使用していないためである。
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| Expenditure Plan for Carryover Budget |
今年度中には時期に菌株調製を終え、菌体内外のポリアミン量を測定する計画である。ポリアミンオキシダーゼを持つかどうかを確認するためにプトレッシンを測定する予定の菌株はできあがったので、近日中に実験に取りかかる予定である。
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