2017 Fiscal Year Annual Research Report
Establishment of novel bacterial functions with macromolecular compelxes of proteases and virus-like membrane vesicles and their application
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15K07366
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| Research Institution | Kyoto Prefectural University |
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Principal Investigator |
渡部 邦彦 京都府立大学, 生命環境科学研究科, 教授 (90184001)
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| Co-Investigator(Kenkyū-buntansha) |
川崎 一則 国立研究開発法人産業技術総合研究所, 生命工学領域, 主任研究員 (40356837)
増村 威宏 京都府立大学, 生命環境科学研究科, 教授 (50254321)
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| Project Period (FY) |
2015-04-01 – 2018-03-31
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| Keywords | 膜小胞 / プロテアーゼ / ジスルフィドオキシダーゼ / 表面提示 |
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| Outline of Annual Research Achievements |
好熱性細菌Meiothermus ruber H328株によるトリ羽毛分解能の増強は、これまでターゲットしてきたプロテアーゼにかかる２つのタンパク質遺伝子だけでなく、羽毛ケラチンに多数含まれるジスルフィド結合に対して作用する酵素protein disulfide oxidase の関与を示すことができた。特に、H328株中のPdo7遺伝子は、この遺伝子破壊株の羽毛ケラチン分解能が著しく低下することから、羽毛分解に大きく関わることを示した。具体的には、機能未知遺伝子mrh-1220 の5'上流域にあるう転写のプロモーターを、-35領域、-10領域のコンセンサス配列情報との相同性から強力プロモーターとして選別し、これをPdo7遺伝子上流に、強力なプロモーターを挿入することで、Pdo7遺伝子の発現を強化した。その結果、培養初期におけるPdo7還元活性の上昇が生じ、プロテアーゼ非依存的なトリ羽毛分解の促進が明らかになった。別途、degP遺伝子破壊株を用いた膜小胞産生能の増強は、蛍光色素DiIを用いた分析法により、繰り返し確認することができた。しかし、羽毛の存在しない培地での現象に留まっており、羽毛含有培地での膜小胞産生強化の確認を取る必要がある。加えて、膜小胞の質的コントロールとして、膜小胞表面提示のために、細胞表層に最も多く存在しているタンパク質S-layerタンパク質を融合させることで可能性を探るとしていたが、S-layerタンパク質の欠損が、H328株にとって致死となるため、融合タンパク質としての発現ターゲットになれないことが判明した。このことから、別途 TMHMMソフトウエアにより探索したところ、新たに３つの候補遺伝子が明らかになった。現在、異なるソフトウエアによる解析も含め、さらに検索を進め、上記３つの遺伝子を中心に、膜小胞表面提示タンパク質の候補を追究している。
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