2015 Fiscal Year Research-status Report
枯草菌の緊縮転写制御ネットワークの先導的基盤研究とその活用
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15K07374
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| Research Institution | Fukuyama University |
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Principal Investigator |
藤田 泰太郎 福山大学, 生命工学部, 教授 (40115506)
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2015-04-01 – 2018-03-31
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| Keywords | 緊縮制御 / 枯草菌 / 転写制御 / 代謝制御 / 胞子形成 / kinB / 転写開始 / 転写ネットワーク |
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| Outline of Annual Research Achievements |
枯草菌の胞子形成は細胞分化のモデルと考えられ、活発に研究が行われてきた。しかし、胞子形成開始に関わる代謝制御機作は未だに謎に満ちている。最近、本研究代表者は、胞子形成のトリガー遺伝子kinB(並びにkinA)は緊縮状態に曝されると転写開始点のアデニンからの転写が活性化される、すなわち正の緊縮転写制御をうけることを見出した。kinB遺伝子の転写制御に関わる因子をkinBのプロモーターとlacZとの融合系を用いて探索したところ、既知のCodY、AbrBやSpo0Aの欠損では影響を受けず、SinRの欠失で影響を受けることが分かった。欠失解析によりSinRの結合部位を探索すると、kinBの転写開始点(+1)の上流域(-65～-55)に存在することが分かり、その部位とｰ45を中心とする部位に直接反複配列(TAAAGG)があることがあることが分かった。そこで-45GをAに置換したところSinRでの抑制が弱くなった。上流のTAAAGGを含む5塩基欠失とｰ45AのGへの置換はSinRによる転写抑制解除に相加的に働いていた。この胞子形成開始時のSinRによるkinBの抑制解除は、kinBの正の緊縮制御とは独立しているものであるが、胞子形成開始時にSinRが不活性化しkinBの転写が上がり、胞子形成を引き起こし易くしていると思われた。まだ現在のところ予備的結果であるが、SinRがkinBやilv-leuなどの正の緊縮転写制御の作動に関与するが、ptsGやpycAなどの負の緊縮転写制御には関与していないことが明らかになった。現在SinRの正の緊縮転写制御への関与の詳細を解析中である。
また、転写開始点のプリン塩基種に依存した緊縮制御遺伝子の次世代シーケンサーを用いたトランスクリプトーム解析とオリゴキャッピング法により体系的に転写開始点の同定を進めたが、信頼できる結果を得るに至っていない。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.
Reason
平成27年度の研究計画は、枯草菌の緊縮転写制御ネットワークの全体像を掴むことと、正の緊縮制御下にある胞子形成開始を担うkinAとkinBの転写制御の詳細を明らかにすることである。前者はDNAシーケンサーを用いた体系的な緊縮遺伝子の検索とその転写開始点の同定であるが、技術的な問題で信頼できる結果が得られなかった。しかしながら、胞子形成の一義的なトリガーであるkinB遺伝子の転写制御に関わる因子をkinBのプロモーターとlacZの融合系を用いて探索したところ、SinRの欠失がkinB発現に影響を与えることが分かった。さらにkinBプロモーター上流のSinRの結合配列を欠失解析により探索すると、直接反複配列(TAAAGG)が存在し、この反復配列の各々の欠損は相加的に抑制を解除した。この胞子形成開始時のSinRによるkinBの抑制解除は、kinBの正の緊縮制御とは独立したものだがkinBの転写制御の解明での大きな成果と言える。さらに、ごく最近の予備的な知見であるが、驚いたことにSinRがkinBやilv-leuなどの正の緊縮転写制御に関与しているが、ptsGやpycAなどの負の緊縮転写制御には関与していないことが明らかになった。この発見は、SinRが正の緊縮転写制御のどの過程に関与するかという、本研究課題の根源的問題を提示するものであり、その解決は枯草菌の緊縮制御機作の解明に大きなインパクトを与える。
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| Strategy for Future Research Activity |
枯草菌kinB遺伝子は活性化されると胞子形成へと向かわせる一義的な胞子形成のトリガー遺伝子である。昨年度のkinB遺伝子の転写制御の研究の結果、kinBはバイオフィルム形成のマスター制御因子SinRにより転写抑制されていることを明らかにした。また、SinRは、アミノ酸飢餓やGMP合成酵素阻害剤デコイニンの添加により作動する緊縮転写制御のうち、kinBやilv-leu等の正の緊縮制御の作動不能にするが、ptsGやpycA等の負の緊縮制御には影響しないことを見出した。このSinRが正の緊縮制御へ関与することの発見は、これまでの正の緊縮制御機作の見直しを迫るという緊縮転写制御研究に大きなインパクトを与える。そこでSinRが如何に正の緊縮転写制御に関わっているかを明らかにすることを本研究課題の主課題に据える。まず、SinRの欠損がデコイニン添加と栄養増殖終了による胞子形成能に如何なる影響を与えるかを形態学的に観察する。デコイニン添加前および後のsinR欠損株細胞内のATPとGTP濃度を測定して、野生株細胞内のそれらの濃度と比較する。即ち、sinR欠損細胞でも、デコイニン添加によるGTP濃度の減少とそのフィードバック制御によるATPの増加が起こるか検証する。SinRとSinIを大腸菌に産生させ、精製する。精製SinR（さらにSinI）を生体外転写系に加え、ATP濃度に依存した正の緊縮転写制御が生体外で再構築できるか検証する。また、精製したSinRを用いてkinBプロモーター上流のフットプリント実験を行いin vivo実験で推測した結合配列を実証する。
また、上記主研究に加えて、昨年度よりの積み残しの、転写開始点のプリン塩基種に依存した緊縮制御遺伝子の次世代シーケンサーを用いたトランスクリプトーム解析とオリゴキャッピング法により体系的な転写開始点の同定を進める。
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| Causes of Carryover |
平成２７年度の当該科研費による研究成果の学会発表のための旅費（65,000円）を計上していたが、大学の経費により該当旅費を支出でき本科研費からは支出しなかった。また、物品費や人件費・謝金もそれぞれ50,825円と71,812円が残額となり、旅費の残額と合わせた、187,637円を人件費・謝金の増額が予想される平成２８年度の経費に回した。
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| Expenditure Plan for Carryover Budget |
平成２７年度に187,637円の残額が生じたが、この額は平成２８年度に増額が予想される人件費・謝金に充てる予定である。
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Research Products
(3 results)
