2015 Fiscal Year Research-status Report
結核菌におけるNAD代謝経路の解析とその代償的経路の解明
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15K07377
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| Research Institution | National Institute of Infectious Diseases |
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Principal Investigator |
森 茂太郎 国立感染症研究所, 細菌第二部, 室長 (60425676)
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| Project Period (FY) |
2015-10-21 – 2018-03-31
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| Keywords | 結核菌 / NAD生合成 / タンパク質発現 |
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| Outline of Annual Research Achievements |
本研究課題では、大きく分けて次の２つの研究を進めることを目的としている。(1) 結核菌におけるNAD生合成経路の解析： 結核菌のNAD生合成経路に関わっているが詳細な機能や構造が未知のタンパク質について、その機能と構造の相関を解析する。(2) NAD合成経路の代償的経路の解明：結核菌はNAD生合成経路で重要な酵素をコードしている遺伝子 (pncA) を変異させて薬剤耐性を獲得するが、このpncA変異株では代償的経路が働くことによってNADの生合成を補っていると考えられる。そこで、この代償的経路に関わっている遺伝子・タンパク質を同定してその機能や生理的な役割を明らかにする。
本年度は、結核菌のNAD生合成経路に関わっているが詳細な機能や構造が未知のタンパク質であるRv0212c、Rv1901C、Rv3199c、及びRv3393について、大腸菌内での発現を試みた。その結果、Rv3393のみが可溶性タンパク質として発現した。一方、Rv0212c、Rv1901C、及びRv3199cについては、可溶性タグ（大腸菌由来シャペロン）を付加させることによって、可溶性タンパク質として発現させることが出来た。可溶性タンパク質として発現したRv3393、及び可溶性タグを付加させたRv0212cについてFPLCを用いてSDS-PAGE上で単一バンドになるまで精製を行った。現在は、得られた精製タンパク質を用いた機能解析と結晶化条件のスクリーニングを行っている。
一方、NAD合成経路の代償的経路を解明する目的で、抗結核薬の一つであるピラジナミドを用いた突然変異誘発によってpncA遺伝子が変異した結核菌の作製を試みた。結核菌の生育速度が非常に遅いため、本年度中にpncA変異株を取得することは出来なかった。今後も引き続き、pncA変異株の作製を進める予定である。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.
Reason
本研究課題の採択時期が10月であり実際に研究を行った期間が半年間であったことから、pncA変異株の取得までには至らなかったが、それ以外の項目については順調に進展している。
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| Strategy for Future Research Activity |
結核菌のNAD生合成経路に関わっているが詳細な機能や構造が未知のタンパク質であるRv0212c、Rv1901C、Rv3199c、及びRv3393について、HPLC等を用いて機能を解析するとともに、X線結晶構造解析によって立体構造を決定する。得られた立体構造情報を基にアミノ酸置換体等を作製してその機能を調べることにより、標的タンパク質の機能構造相関解析を行う。
本研究課題で作製したpncA変異株について、リアルタイムPCRや二次元電気泳動、質量分析計などを用いた解析を行うことにより、NAD生合成経路の代償として働いている遺伝子・タンパク質を明らかにする。さらに、同定した遺伝子・タンパク質の機能についてHPLC等を用いて解析するとともに、相同性組換えによって該当遺伝子を破壊した結核菌の破壊株を作製することによって同定した遺伝子やタンパク質の菌体内での生理的な役割についても明らかにする。さらに、pncA変異株は抗結核薬ピラジナミドに対して耐性を示すが、pncAに加えて代償的経路に関わる遺伝子も破壊した株におけるピラジナミド耐性についても検討を行う。
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| Causes of Carryover |
年度末納品等にかかる支払いが平成28年4月1日以降となったため、当該支出分については次年度の実支出額に計上予定。
平成27年度分についてはほぼ使用済みである。
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| Expenditure Plan for Carryover Budget |
上記のとおり。
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