2015 Fiscal Year Research-status Report
最高活性ターミネーターである酵母DIT1tの分子作用機序の解明とその応用
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15K07378
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| Research Institution | Toyota Central R&D Lab., Inc. |
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Principal Investigator |
松山 崇 株式会社豊田中央研究所, 社会システム研究領域 健康創出プログラム, 主任研究員 (90394882)
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| Co-Investigator(Kenkyū-buntansha) |
井沢 真吾 京都工芸繊維大学, 応用生物学系, 准教授 (10273517)
北川 孝雄 山口大学, 医学(系)研究科(研究院), 助教 (20614928)
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| Project Period (FY) |
2015-04-01 – 2018-03-31
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| Keywords | 遺伝子発現 / ターミネーター / 出芽酵母 / RNA結合タンパク質 |
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| Outline of Annual Research Achievements |
・これまでに判明しているDIT1ターミネーターのcis配列を含むと考えられた近辺の配列を3bp欠損した15種類の変異型DIT1ターミネーターのデリーション・クローンを作製し、NAB6遺伝子とPAP1遺伝子の過剰発現アッセイを行った。その結果、連続する2種類の変異型ターミネーター（d15, d16）において、DIT1ターミネーター活性化が失われていた。これらの領域は、以前の10bp欠損によりDIT1ターミネーター活性化が失われた変異型DIT1ターミネーターd2と重複していた。以上の結果より、d15とd16で欠損した配列GUUCGAが活性化に関与するcis配列であることが判明した。続いて、cis配列を含む周辺の塩基配列を飽和点変異した30種類の変異型DIT1ターミネーターを作製し、同様の過剰発現アッセイを行った。その結果、ほとんどの変異型DIT1ターミネーターで活性化が弱くなることが見いだされた。特にcis配列の変異において、1種類の変異型DIT1ターミネーターを除いて、活性化が失われたことから、活性化に関与するcis配列はGUUCG/Uと厳密に決定された。
・変異型DIT1ターミネーターのうち、d7とd21は野生型DIT1ターミネーターよりも高い活性を示した。これらの変異を集積したd22変異型DIT1ターミネーターはさらに高い活性を持つことを明らかにした。
・セルラーゼ遺伝子のタンパク質分泌生産において、高出力プロモーターと高活性ターミネーターの組み合わせが相乗的に効果を発揮することを明らかにした。
・NAB6遺伝子は細胞壁合成に関わる遺伝子のmRNAに結合することが以前に報告されていたため、細胞壁合成阻害剤がnab6変異株に与える影響を調べた。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.
Reason
・Nab6タンパク質が結合すると考えられるcis配列GUUCG/Uを厳密に決定した。これまでRNA結合配列が厳密に決定された例は少なく、本研究によって新規なcis配列を同定したことは、RNA結合タンパク質とmRNAにより構成される制御ネットワークを解明する上で、大きな成果と考えられた。
・応用的な観点から、これまでに見つかった最強ターミネーターであるDIT1ターミネーターの1.5倍の活性を有するターミネーターを構築することが出来たことは、大きな成果と考えられた。
・その一方、何種類かの発現ベクター（GSTタグ有無しなど）、培養条件を検討したものの、Nab6タンパク質全長の大腸菌を用いた大量発現には成功していない。Nab6タンパク質は126kDaと分子量が大きいこと、また、RNAと非特異的に結合して細胞に何らかの悪影響を与えていることが原因として考えられた。そこで、Nab6タンパク質は４つのRNA結合部位（RRM）を有するので、それぞれを発現ベクターに組み込んで発現を試みた。その結果、RRM1, RRM3, RRM4を発現できたものの、RRM2は発現できなかった。
・セルラーゼ遺伝子のタンパク質分泌生産において、高出力プロモーターと高活性ターミネーターの組み合わせが相乗的に効果を発揮することを明らかにした。DIT1ターミネーターを代謝工学に応用する上で、重要な結果が得られた。
・NAB6遺伝子、及び遺伝学的に同じ経路で働くことが示されているPAP1遺伝子を過剰発現させることによって、目的の外来遺伝子の発現量を大幅に増やすことができる。しかしながら、酵母の生育を阻害することも明らかとなった。この原因を調べるため、細胞壁合成阻害剤を用いたアッセイにより、NAB6遺伝子が細胞壁成分の調節に影響を与えることが明らかになり、今後の解析によって、基礎的にも応用的にも重要な知見が得られると考えられた。
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| Strategy for Future Research Activity |
・DIT1ターミネーター活性化に関わるcis配列は同定されたものの、Nab6タンパク質が、この配列と直接結合しているかどうか、は不明である。これまで、Nab6タンパク質が結合するmRNAに関する網羅的な解析結果が報告されている。そこで、これらの遺伝子のターミネーターがNAB6遺伝子とPAP1遺伝子の過剰発現によって活性化されるかどうかを明らかにしたい。また、3'-UTRに今回同定されたcis配列が含まれるかどうか、を調べる予定。
・今回の報告でd22変異型DIT1ターミネーターの活性が高いことが判明したので、プロモーターや目的遺伝子を交換した場合でも同じように活性が高いかどうかを調べる。さらに、今回親株として用いたW303-1aでない親株を用いた場合でも、同じように活性が高いかどうかを調べる。
・Nab6タンパク質の大量発現については、様々な誘導条件や培養条件を試す。
・nab6変異株においてbeta-1,3-glucanの合成阻害剤caspofungin、キチンと結合して生育阻害を惹起する薬剤congo redへの感受性が野生株と異なることが明らかになったので、beta-1,3-glucan合成酵素遺伝子FKS1及びFKS2との二重変異株を作製し、NAB6遺伝子の作用点を明らかにしていきたい。
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