ゴマ搾り粕から高効率な有用物質生産を可能にする新規酵素の分子解析と応用

2015 Fiscal Year Research-status Report

• Project/Area Number: 15K07380
• Research Institution: Kanazawa University
• Principal Investigator: 山下 哲 金沢大学, 物質化学系, 准教授 (70361186)
• Project Period (FY): 2015-04-01 – 2018-03-31
• Keywords: 脂溶性有用物質

Outline of Annual Research Achievements

本研究はゴマ油に含まれる抗酸化能の高いリグナンであるセサミノールを，ゴマ絞り粕に存在する難分解性のセサミノール配糖体を有効に利用するため，単一酵素でセサミノールを高効率で生産可能な新規酵素であるPSTGについて，構造学的手法と酵素学的手法による分子解析によって，そのユニークな触媒機構を解明することを目的としている．
本年度はPSTGの立体構造を解明するために，結晶化を試みた．結晶化に必要なサンプルの取得に当たり，大腸菌におけるタンパク質発現の条件を改めて最適化した．その結果，既に国際誌に投稿済みの組換え型PSTG調製のための従来法と比較し，大腸菌の培地の体積あたりで１０倍以上の可溶性酵素を得る条件を発見した．これによって，２７年度の結晶化計画のみならず，２８年度以降に予定している高活性型酵素創出と固定化酵素による連続的セサミノール生産系確立のための酵素供給法が解決した．結晶化に適したサンプルの調製のため，タンパク質の精製ステップの見直しも行い，従来のアフィニティークロマトグラフィー精製に加えて，陰イオン交換樹脂とゲルろ過クロマトグラフィーを連続的に行うことにより，純度の高い精製PSTGを得ることができた．従来法で得た精製酵素では，結晶化条件スクリーニングでのヒット数がほぼ無かったのに対し，新規精製酵素では，約１００条件の探索当たり，数個～１０個のヒットが得られるように改善した．約５００条件の探索を行い，良質な結晶を選抜し，条件の微調整による最適化を継続した．その過程で，ベースとなる結晶化の基本条件に対して，臨界ミセル濃度以下の界面活性剤の添加が非常に有効であることを明らかにした．現在，界面活性剤添加で得られた良質な結晶を用いて，X線回折実験にてデータ収集を行う準備を進めている．

Current Status of Research Progress

2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.

Reason

本年度はPSTGの構造学的研究を推進し，現在構造情報が全く未知の同酵素の純品タンパク質から初めて結晶化に成功した．結晶化のための試料調製を最適化する過程で，次年度以降の計画に極めて重要な，高純度タンパク質サンプルの大量調製についての手法を確立することができた．これにより，３年間の研究実施計画全体の迅速化と効率化が計られると期待される．
本酵素は現在まで同等な活性を持つ他の酵素は単離されておらず，したがって立体構造に関する知見はX線結晶構造解析以外の手法（NMRやX線小角散乱など）においてまだ報告がない．PSTGは可溶性タンパク質と考えられているため，高純度なタンパク試料からは良質な結晶が容易に得られることが当初期待された．しかしながら，PSTGの生成物であるセサミノールは脂溶性であり，生体内または環境中で機能する場合，疎水的環境を好むことも考えられる．上記に関連して，PSTG結晶化条件探索中に得られた初期の結晶群から，部分的な疎水性の高い領域を持つことが予想される挙動が観察された．そこで，通常は膜タンパク質の結晶化に使用するような界面活性剤の網羅的なスクリーニングを行い，結晶の質が改善することを見出した．この発見が大きなブレークスルーとなり，現在は使用する界面活性剤濃度の最適化によって，良質な結晶を再現性良く得ることに成功している．したがって，次年度はX線回折実験に迅速に移行することによって，構造決定のためのデータ収集が期待される段階にある．

Strategy for Future Research Activity

今後の研究推進方策として，すでに次年度計画中にある高活性型酵素創出に着手している．PSTG生産菌であるPaenibacillus細胞への突然変異誘発により，菌体レベルで酵素活性の上昇したもののゲノム解析を行っており，本解析が進むにつれ，変異導入箇所が明らかになると思われる．その結果を参考にし，理論的分子設計により，高活性型酵素の作出を試みる．また，今年度の成果で，従来の１０倍以上の高効率的なPSTG生産が可能になったことから，次年度以降の計画中にある固定化酵素による連続的なセサミノール生産系の確立にも着手する．PSTGの高純度酵素の調製に用いられた陰イオン交換樹脂などは，PSTGの特異的な固定化に応用されることが期待できる．
結晶化と構造決定の実験においては，X線回折実験を迅速に進め，構造決定のためのデータ収集を進める．上記の高活性型酵素についても，同じく結晶化と構造決定を試みる．理論的分子設計に関する一連の作業において，PSTGの分子内部で可動性が高く，高いコンフォメーションエントロピーを持つと予想されるグルタミン酸残基やリシン残基などをアラニンなどに置換し，結晶の良質化を促し，さらなる高分解能データの収集を狙う．また，PSTGの触媒残基決定に関しては，ホモロジーモデリングによって推定触媒残基の候補を絞り，現在部位変異導入実験を開始している．

Causes of Carryover

本年度計画中に，申請者はタンパク質精製装置および結晶化のための消耗品と結晶化専用のプログラム低温恒温器等の購入を検討していた．しかし，目的タンパク質であるPSTGの生産において，従来よりも遥かに高効率な手法を確立できたため，タンパク質精製装置関連およびその他のルーチンワークに使用する消耗品の購入金額を抑えることができた．さらに，プログラム低温恒温器においては，国内の放射光施設などにおいて使用されている他のメーカー製の機器に変更したことにより，購入台数を当初の２台から３台に変更したが，トータルの購入金額を抑えることができた．また，旅費に関して，放射光施設への出張を今年度中は控え，現在の所属部局や近郊の大学の共通機器の使用を計画し，使用準備を進めていたため，旅費としての使用額が抑えられた．

Expenditure Plan for Carryover Budget

次年度においては，現在得られている目的タンパク質の結晶を用い，X線回折実験を行うため，関連した消耗品の購入額が増加することが予想される．また，高分解能のデータ収集を目的として，国内の放射光施設での実験計画を立て，ビームタイムの申請と使用準備が整い次第，出張して実験を行う（年数回を計画）．使用する実験施設はつくばの高エネルギー加速器研究機構などであるため，出張旅費が今年度に比較して多く必要になることが予想される．また，申請者は本年度中に金沢大学理工研究域に異動したため，共同研究者である東北大学工学部の中山亨教授との打ち合わせ（半年に一度を計画）のための旅費が必要である．