2016 Fiscal Year Research-status Report
小胞体から出芽する輸送小胞の形成調節機構の解明と応用
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15K07384
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| Research Institution | Nagoya University |
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Principal Investigator |
柴田 秀樹 名古屋大学, 生命農学研究科, 准教授 (30314470)
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| Project Period (FY) |
2015-04-01 – 2018-03-31
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| Keywords | カルシウム / COPII小胞 / 小胞輸送 / 分泌経路 |
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| Outline of Annual Research Achievements |
本研究は、哺乳類細胞の小胞体からゴルジ体への輸送を担うCOPII小胞の出芽の調節機構を解明することで、高機能タンパク質を大量に分泌可能な細胞系樹立の一助とすることを目的としている。すでに、COPII小胞の外被覆を構成するSec31Aにカルシウム結合タンパク質ALG-2が結合し、COPII小胞が出芽する特別な領域（ERES, ER exit sites）に動員されることを報告しているが、昨年度、ERESに局在するタンパク質TFG（Trk-fused gene）にALG-2が結合することを明らかにした。本年度は、ALG-2とTFGの相互作用の生理的意義を解明する目的で解析を進め、以下の結果をまとめ報告した。1) ALG-2二量体がもつアダプター機能によって、Sec31AとTFGがALG-2を介してカルシウム依存的に相互作用する可能性を免疫沈降実験により検討したところ、Sec31Aの免疫沈降産物中にALG-2は検出されたが、TFGは検出されなかった。よって、ERESにおいて、ALG-2/TFG複合体はALG-2/Sec31A複合体と独立して存在することが考えられた。2) 免疫染色実験によりALG-2の過剰発現がTFGのERES局在を増強することを見出した。3) 組換体タンパク質を用いた試験管内架橋実験により、多量体を形成しているTFGをALG-2がカルシウム依存的にポリマー化することを明らかにした。4) TFGの点変異(R106C)を引き起こす一塩基多型は遺伝性痙性対麻痺の発症と関連するが、ALG-2はTFGのR106C変異体とは結合しないことを示した。
また、Sec31Aの免疫沈降産物から、質量分析により相互作用するタンパク質の網羅的同定を試み、Sec31Aの正常な折りたたみに関与する可能性のあるタンパク質複合体が含まれることを見出している。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.
Reason
COPII小胞が出芽する小胞体の膜区画ERESにおいて、カルシウム結合タンパク質ALG-2がカルシウム依存的にTFGをERESへ動員すること、またTFGのポリマー化を促進するという新たな分子機構を明らかにし、報告した。ALG-2がカルシウムに応答して、ERESのSec31AとTFGをそれぞれ独立に制御していることから、カルシウムシグナルによって初期分泌経路が巧妙に調節されている可能性があり、今後の展開が期待される。一方で、Sec31Aのカルボキシル末端領域のGFP融合タンパク質を恒常発現する動物培養細胞を樹立した。その細胞溶解液から抗GFP抗体を用いて免疫沈降し、沈降産物中に含まれる結合タンパク質候補を質量分析技術により数多く同定した。それらのいくつかについてSec31Aとの結合の検証実験を行ったが、特異的な結合は検出されなかった。そのため、この実験系によってSec31Aの新規相互作用タンパク質を同定することは困難と判断し、全長のSec31Aに結合するタンパク質の同定を試みた。その結果、Sec31Aの正常な折りたたみを担う可能性のあるタンパク質複合体が同定された。現在、複数の実験系でその結合の検証を進めており、一部の実験系では特異的な結合が確認できている。以上のように、本研究は全体としておおむね順調に進展している。
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| Strategy for Future Research Activity |
Sec31AはSec13とのヘテロ4量体として細胞質に存在し、COPII小胞を形成するために、細胞質からERESに動員される。Sec31Aの結合候補タンパク質複合体について、その機能欠損や発現抑制が、Sec31AとSec13のヘテロ4量体形成およびSec31AのERES局在に与える影響を解析する。また候補タンパク質複合体の発現抑制細胞を作出し、種々のタンパク質の輸送を追跡して分泌経路に与える影響を検討する。さらに、これまで得られたSec31Aのタンパク質分泌調節メカニズムに関するデータをもとに、Sec31Aの機能を正に制御する変異体の創出を試みる。
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| Causes of Carryover |
研究計画に沿って実験を進めていたが、一部に遅れが生じたため、今年度に予定していた消耗品の購入を差し控えた。そのため次年度の使用額が生じた。
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| Expenditure Plan for Carryover Budget |
次年度の消耗品の購入に使用する。
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