2016 Fiscal Year Research-status Report
Characterization of novel phosphorylases and synthesis of functional carbohydrates
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15K07386
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| Research Institution | Mie University |
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Principal Investigator |
磯野 直人 三重大学, 生物資源学研究科, 准教授 (70378321)
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| Co-Investigator(Kenkyū-buntansha) |
勝崎 裕隆 三重大学, 生物資源学研究科, 准教授 (10262990)
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| Project Period (FY) |
2015-04-01 – 2019-03-31
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| Keywords | ホスホリラーゼ / β-1,3-グルカンホスホリラーゼ / ラミナリデキストリンホスホリラーゼ / β-1,3-1,4-グルカン / ラミナリデキストリン |
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| Outline of Annual Research Achievements |
Ochromonas danica由来β-1,3-グルカンホスホリラーゼ (OdBGP, EC 2.4.1.97) と相同性を示すタンパク質のうち、アミノ酸配列類似性、遺伝子クラスター構造、菌株の病原性の有無などを考慮した上で、4種類の機能未知タンパク質の機能解析を試みた。pCold2を用いたコールドショック発現システムによりタンパク質を生産し、ニッケルカラムで精製した。酵素活性を調べたところ、このうちPaenibacillus glucanolyticus由来のタンパク質（OdBGPとの類似性は50%）はBGPであることが明らかとなった。以前に発見したPaenibacillus polymyxa由来のBGPと比べて熱安定性に優れていた。また、Halobacillus halophilus由来のタンパク質については、様々な基質を用いて酵素活性を調べているが、まだ機能を同定できていない。一方で、隣接遺伝子がGH30に属するβ-グルコシダーゼであることを明らかにした。他の2種類については現在機能解析中である。
様々な起源のBGPとRuminiclostridium thermocellum由来セロデキストリンホスホリラーゼ(CDP, EC 2.4.1.49)を用いて、セロビオース (2 mM)をアクセプター、α-グルコース 1-リン酸 (100 mM)をドナーとして反応を行った。BGPとCDPの濃度比率がある範囲内の場合においてのみ、可溶性の多糖が合成された。合成多糖のメチル化分析を行ったところ、β-1,3-1,4-グルカンであることが明らかとなった。
Melioribacter roseus由来ラミナリデキストリンホスホリラーゼ (EC 2.4.1.30)を用いて、ラミナリビオース(0.4~4 mM) をアクセプター、α-グルコース 1-リン酸 (100 mM) をドナーとして反応を行った。反応産物のメチル化分析を行ったところ、ラミナリデキストリンであることが明らかとなった。また、サイズ排除HPLCで分析したところ、この酵素合成ラミナリデキストリンのDPnは15~18、DPwは16~20であった。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
3: Progress in research has been slightly delayed.
Reason
当初の予定よりも本研究を実施可能な時間が少なく、分析対象とした機能未知タンパク質の数が限られることになった。
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| Strategy for Future Research Activity |
引き続きホスホリラーゼと相同性を示す機能未知タンパク質の機能解析を行う。また、β-1,3-1,4-グルカンの合成条件の検討と、詳細な構造解析を行う。なお、補助事業期間の延長も検討している。
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| Causes of Carryover |
当初の予定よりも本研究を実施可能な時間が少なく、分析対象とした機能未知タンパク質の数が限られることになった。
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| Expenditure Plan for Carryover Budget |
微生物試料・合成DNA・薬品・プラスチック器具などの消耗品を購入する。また、学内機器使用料や学会への出張旅費として使用する。設備備品の購入は予定していない。
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