The post-translational modification of NAD kinase governing the regulation of concentrations of cytosolic and mitochondrial NADP(H)

2017 Fiscal Year Annual Research Report

• Project/Area Number: 15K07387
• Research Institution: Kyoto University
• Principal Investigator: 河井 重幸 京都大学, 農学研究科, 助教 (00303909)
• Co-Investigator(Kenkyū-buntansha): 村田 幸作 摂南大学, 理工学部, 教授 (90142299)
• Project Period (FY): 2015-04-01 – 2018-03-31
• Keywords: NADキナーゼ / 翻訳後修飾 / NADP+ / NAD+ / フォスフォプロテオミクス解析 / Sirtuin / リン酸化

Outline of Annual Research Achievements

NADキナーゼ (NADK) はNADP+の合成酵素であり、ヒト細胞では細胞質局在型NADKとミトコンドリア (Mit) 局在型NADK (応募者が特定; Nature Commun. 2012) が機能している。
真核生物のモデル生物である出芽酵母のcytNADK (Utr1) ならびにmitNADK (Pos5) 各々のリン酸化部位の特定を試みた。先ずUtr1に着目し、3’側にFLAGタグを導入したUtr1遺伝子をプラスミド（UTR1::FLAG.415またはUTR1::FLAG.425）を介してUtr1欠損株（utr1株）に導入し、グルコース含有合成培地で培養して得られた対数期、対数期後期、定常期の細胞のUtr1のリン酸化を調べたところ、低コピープラスミド使用時は非特異的シグナル等のために明瞭なシグナルが得られず、多コピープラスミド使用時はUtr1pの分解が観察された。そこで、低コピープラスミドを導入した対数期後期の細胞から免疫沈降したUtr1::FLAGにフォスファターゼを作用させ、Phos-Tagで分析したところフォスファターゼに依存したバンドシフトが観察されたため、当該Utr1::FLAGはリン酸化されていると判断した。同Utr1::FLAGをSDS-PAGEゲルから切り出し、リン酸化部位の同定を試みた。しかし、プロテインシーケンスのカバレッジは8%であり、リン酸化部位の特定には至らなかった。再度TAPタグを融合したUtr1とPos5の系に戻り、Phos-tagを用いてリン酸化を追跡した。前培養条件を栄養（YPDA）培地または合成（SC）培地で行い、本培養もYPDAまたはSC培地で行った。振とう数は静置条件と好気条件を試した。対数期、対数期後期、定常期でサンプリングした。TAPタグの系では非特異的シグナルは検出されなかった。また、少なくともUtr1のリン酸化による明瞭なバンドシフトは観察されたが、そのリン酸化を引き起こす要因の特定には至らなかった。