2016 Fiscal Year Research-status Report
高温proteolysisによる異常プリオンタンパク質コア構造の解析
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15K07392
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| Research Institution | Osaka University |
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Principal Investigator |
古賀 雄一 大阪大学, 工学研究科, 准教授 (30379119)
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| Project Period (FY) |
2015-04-01 – 2018-03-31
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| Keywords | 超好熱菌 / プロテアーゼ / プリオン |
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| Outline of Annual Research Achievements |
異常プリオンタンパク質はクロイツフェルト・ヤコブ病（CJD）のタンパク質性感染因子とされる。異常型プリオンタンパク質が鋳型となって通常型タンパク質を異常型に構造変化させる構造伝播の分子メカニズムは明らかになっていない。超好熱菌由来のプロテアーゼは、蛋白質変性条件下でも十分にタンパク質分解活性を有するため、本酵素を用いれば、オリゴマーを形成した異常プリオンタンパク質を、これまでにない形で分解することができる。ここで分解される可能性があるのは、プリオンタンパク質の中でも変性条件下でもプロテアーゼに対して分解されにくい溶媒に露出していない部位と考えられる。このような部位はマウス脳内で異常プリオンタンパク質分子同士が会合している部分である可能性が高い。この分解産物がどの程度の感染性を有しているのかを検証する必要性があった。
プリオンタンパク質を蓄積したマウス脳ホモジネートと、超好熱菌由来プロテアーゼ、界面活性剤等を混ぜて、60℃～100℃で作用させ、マウス脳ホモジネートに含まれるタンパク質を分解し、抗プリオン抗体でウエスタンブロット検出した。超好熱菌由来プロテアーゼで作用すると、異常型プリオンタンパク質が分解されることが確認された。プリオンタンパク質のC末端領域に作用する抗体で標識した場合、およそ10kDaの特異的な分解産物が得られることも確認された。
マウスの培養細胞に分解産物を添加しで継代培養し感染させた。継代後細胞内蓄積した異常プリオンタンパク質をウエスタンブロットによって定量して感染性の有無を判定したところ、分解時に界面活性剤を加えたもの、高温で分解したものにおいて、有意な感染性の低下が見られた。熱をかけると、ホモジネート内のタンパク質が凝集し酵素が作用できなくなるが、界面活性剤を添加することで酵素を効率的に作用させることができたと思われる。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.
Reason
昨年度までに確認された分解産物の感染性について、培養細胞を用いた実験によってその感染性の低減を示唆するデータが得られている。構造伝播に分解産物が関わる可能性が示唆されるデータであり、10kDaタンパク質の構造的な解析の意義が確認されている。
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| Strategy for Future Research Activity |
10kDaタンパク質の分取と構造伝播特性の変化について検討する。また、超好熱菌のプロテアーゼの大量生産が望まれる。そのために、発現系の効率化に向けた取り組みをすすめる。
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