2016 Fiscal Year Research-status Report
高度好塩菌由来2-デオキシリボース-5-リン酸アルドラーゼの機能・構造解析と応用
| Project/Area Number |
15K07395
|
|---|
| Research Institution | Kagawa University |
|---|
Principal Investigator |
櫻庭 春彦 香川大学, 農学部, 教授 (90205823)
|
|---|
| Project Period (FY) |
2015-04-01 – 2018-03-31
|
| Keywords | 高度好塩菌 / アルドラーゼ / 2-デオキシリボース-5-リン酸アルドラーゼ / 結晶構造解析 / アーキア / 抗高脂血症剤 / アルデヒド / Halorhabdus utahensis |
|---|
| Outline of Annual Research Achievements |
2-デオキシリボース-5-リン酸アルドラーゼ（DERA）は、多様なアルデヒド分子間の縮合反応を触媒するため、抗高脂血症剤などのビルディングブロック合成への利用が期待される。しかし通常微生物由来の酵素は基質のアルデヒドで失活するなど、その不安定性から実用化は達成されていない。一方高度好塩菌の酵素は、アセトアルデヒド等の有機溶媒様物質の存在下でも安定で高活性を示すことが期待できる。本研究開始時に、高度好塩菌Haloarcula japonica 由来のDERA遺伝子を大腸菌で発現させ、活性型リコンビナント酵素を取得することに成功している。平成27年度は精製方法を確立し、機能解析に成功した。平成28年度は、他の高度好塩菌由来DERAの活性型リコンビナント酵素取得と結晶化を主要な目的とした。以下にその実績を示す。
（１）H. japonica DERAについては、精製酵素の結晶化条件をスクリーニングしたが、現時点で良好な結晶は得られていない。本酵素については、25℃、300 mMアセトアルデヒド存在下での2,4,6,-トリデオキシ-D-エリスロヘキサピラノシド（TEHP：高コレステロール血症治療薬であるスタチンの合成前駆体として有用）の合成においては、大腸菌や超好熱菌由来の酵素より生産性が優れていることを見出した。
（２）H. japonica以外の他の複数の高度好塩菌DERAホモログ遺伝子のクローニングを行い、Halorhabdus utahensis由来DERAの発現に成功した。H. japonica DERAと同様の手法で精製酵素の大量取得に成功した。
（３）H. utahensis DERAについて精製酵素の結晶化条件をスクリーニングし、複数の条件で、微結晶を得た。現在、結晶化条件の精密化を行い、構造解析に適した結晶の作製を進めている。
|
| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.
Reason
H. japonica DERAについては、NaCl非存在下で精製を行い、高濃度塩処理を用いて活性型酵素への変換に成功し、高純度精製を達成した。精製酵素はアセトアルデヒドに対して極めて高い安定性を示した。本研究は、高度好塩菌DERAを解析した初めての例であり、高度好塩菌DERAの有用性を示すことができた。平成27年度これらの成果をまとめ、本酵素の特許出願を行った（特願2016-049393「アルドラーゼおよびその用途」、2016/3/14）。また、精製方法と性質については、国際誌Protein Expression and Purificationに掲載された。H. utahensis精製酵素溶液に含まれる高濃度の塩を非界面活性型スルホベタインに置換して結晶化を行ったところ、結晶化に成功した。
|
| Strategy for Future Research Activity |
H. utahensis DERAについて、基質特異性、反応のカイネティクス、最適pH、最適温度、温度安定性、pH安定性などの機能解析を行う。また、各種有機溶剤耐性、長期保存性、長時間反応性を調べる。また、得られた結晶を用いて、Ｘ線結晶構造解析を行う。
|
| Causes of Carryover |
構造解析用消耗品・試薬の消費が想定より少なかったため次年度繰越金が生じた。
|
| Expenditure Plan for Carryover Budget |
交付予定が1,100,000円であるため、酵素活性測定用試薬、タンパク質結晶化用試薬として1,000,000円 + 繰越金額、出張旅費100,000円を予定している。
|
