2015 Fiscal Year Research-status Report
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15K07396
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| Research Institution | Ehime University |
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Principal Investigator |
関藤 孝之 愛媛大学, 農学部, 准教授 (20419857)
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| Project Period (FY) |
2015-04-01 – 2018-03-31
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| Keywords | 微生物 / 液胞 / トランスポーター / アミノ酸代謝 |
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| Outline of Annual Research Achievements |
出芽酵母液胞アミノ酸トランスポーターAvt4は窒素飢餓条件で活性化し液胞内アミノ酸をサイトゾルへ供給すると考えられる。同条件でAvt4が脱リン酸化されることを見出し、Avt4のリン酸化とアミノ酸輸送活性の関係について検討するため、Avt4 N末端親水性領域の推定リン酸化部位をアラニンに置換したところ、部分的なアミノ酸輸送活性の増加を検出した。また、Avt4はリン酸化に依存して14-3-3タンパク質であるBmh1と相互作用することが免疫沈降実験より示唆され、Bmh1とそのホモログであるBmh2の二重欠損による液胞内中性／塩基性アミノ酸含量の大幅な減少も検出した。これらの結果よりAvt4はそのリン酸化によって14-3-3タンパク質と相互作用し負に調節されるとの作業仮説を立て、現在解析を進めている。また、シロイヌナズナ、植物病原菌フザリウムおよび分裂酵母のAvt4ホモログが各生物種において液胞膜に局在し、いずれも出芽酵母に発現させると単離液胞膜小胞のATP依存的アミノ酸排出活性が増加したことから、これらホモログは機能的にも保存されていることが示唆された。一方、Avt4基質輸送活性の速度論的解析に向けたプロテオリポソーム再構成実験では、まずAvt4大量精製系の確立を試み、コムギ胚芽無細胞タンパク質合成系によって全長タンパク質と膜貫通領域の高効率な合成を達成できた。さらに、他の液胞アミノ酸輸送系の同定解析も並行して進め、Avt4と同じAAAPファミリーに属するAvt1が中性アミノ酸全般とヒスチジンを液胞内へと取り込むプロトン／アミノ酸アンチポーターであることを報告した。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.
Reason
Avt4のN末端親水性領域推定リン酸化残基へのアラニン置換が進捗し、野生型Avt4がリン酸化される条件（栄養豊富条件）で培養してもSDS-PAGEにおいて脱リン酸化型Avt4とほぼ同じ移動度を示す変異型Avt4を単離している。この変異型Avt4を足がかりとしてリン酸化によるAvt4の活性調節について今後2年間での検討が可能と考える。また、Avt4の大量精製についてはコムギ無細胞合成系を用いることにより目処がつき、リポソームへの再構成条件の検討を開始している。さらに、報告したAvt1以外の液胞アミノ酸輸送系の同定解析も順調に推移しており、液胞内アミノ酸プールを人為的に改変する環境が整いつつある。液胞内アミノ酸の生理機能解明に向け、その改変に伴って生育表現型が現れる培養条件を探索する予定である。
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| Strategy for Future Research Activity |
今回単離した部分的な活性化を示すAvt4アラニン置換変異体へのさらなる変異導入により、活性化型Avt4を単離し、そのBmh1/Bmh2との相互作用を解析することにより、リン酸化によるAvt4活性調節の具体的な作用機序を明らかにする。現在、Avt4をリン酸化／脱リン酸化するキナーゼ／ホスファターゼのスクリーニングを進めており、Avt4の基質輸送活性への関与について検討する。また、コムギ無細胞タンパク質合成系によって合成したAvt4のリポソームへの再構成系を確立し基質輸送の速度論的解析へと繋げるとともに、精製標品を大量に調製し、結晶化への道筋をつけたい。
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| Causes of Carryover |
試薬の割引により当初予定より安価に購入できたため差額が生じた。
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| Expenditure Plan for Carryover Budget |
次年度、研究に使用する試薬の購入に使用する。
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Research Products
(11 results)
