2016 Fiscal Year Research-status Report
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15K07396
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| Research Institution | Ehime University |
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Principal Investigator |
関藤 孝之 愛媛大学, 農学研究科, 教授 (20419857)
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| Project Period (FY) |
2015-04-01 – 2018-03-31
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| Keywords | 液胞 / トランスポーター / オートファジー / アミノ酸 |
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| Outline of Annual Research Achievements |
出芽酵母液胞アミノ酸トランスポーターAvt4は液胞内の中性・塩基性アミノ酸をサイトゾルへと排出し、窒素飢餓条件でのオートファジーアミノ酸リサイクルにおいて中心的な役割を果たす。本年度はシロイヌナズナホモログの液胞膜局在とアミノ酸輸送活性を明らかにし、植物では初めて液胞からアミノ酸を排出するトランスポーターとして報告した。また、分裂酵母ホモログのN末端親水性領域を欠損した変異型ホモログの解析よりこの領域が液胞からアミノ酸排出に必須ではないが、胞子形成に何らかの機能を有することを報告した。
Avt4は飢餓条件ではサイトゾルへ効率的にアミノ酸を供給するために活性化すると考えられる。我々は Avt4が窒素飢餓条件で速やかに脱リン酸化されることを見出し、予想リン酸化部位のアラニン置換により栄養豊富条件でもほぼ脱リン酸化された変異型Avt4の発現株を構築した。しかしこの発現株の液胞内アミノ酸含量の減少は部分的であったことから、Avt4の活性化に脱リン酸化と重複して機能する別の機構の存在が示唆された。また、プロテインホスファターゼをコードするSIT4の破壊株ではAvt4の窒素飢餓条件での脱リン酸化が遅延し、液胞内アミノ酸含量の減少が部分的に抑制されることを見出した。この株ではさらに細胞内Avt4レベルも低下したことから、Sit4がAVT4の発現にも関与することが示唆された。この点について我々は染色体より発現したGFP融合Avt4の細胞内レベルが窒素飢餓条件で大幅に増加することを見出し、転写因子Gln3とGat1が重複して機能することによって転写段階で調節されることを明らかにした。Sit4はGln3とGat1を活性化することから、転写と翻訳後の両段階でAvt4の活性調節に機能することが示唆された。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.
Reason
我々は14-3-3タンパク質（Bmh1／Bmh2）がAvt4 N末端親水性領域と相互作用することを見出し、そのAvt4活性への関与について検討している。14-3-3タンパク質の欠損は致死的であるため、条件特異的な欠損株を単離し、液胞内アミノ酸含量を測定したが、現段階でAvt4を介したアミノ酸輸送活性への関与を示唆する結果は得られていない。またAvt4のリン酸化がアミノ酸輸送活性に及ぼす影響についてもリン酸化部位に変異を導入し解析したが、液胞内アミノ酸含量の変化は部分的であった。これまではプラスミドからGFP融合Avt4を発現させ、その翻訳後段階での活性調節機構に焦点を絞って研究を進めてきた。AVT4破壊株においてプラスミドから発現したAvt4の細胞内レベルは栄養豊富条件においても窒素飢餓条件とほぼ同等に高レベルだが、液胞内アミノ酸含量は野生株同様の栄養応答を示すため、Avt4発現量の重要性はこれまで未検討であった。しかし、染色体からの発現により栄養条件に応答したAvt4細胞内レベルの変化を見出し、発現調節も考慮した解析が必要となった。これまでプラスミドより発現させていた変異型Avt4を染色体から発現する菌株の単離がほぼ完了しており、液胞内アミノ酸含量、および液胞膜小胞アミノ酸輸送活性への影響評価に向けた基盤が整ったところである。発現調節を含めた今後の解析により、より正確な活性調節機構の理解が可能になると考えられる。また、無細胞タンパク質合成系を使ったAvt4のリポソームへの再構成実験ではAvt4の合成を確認するとともに、プロトン駆動力を供給する大腸菌F-ATPaseについてもATPase活性とプロトン輸送活性を保持したまま精製できており、概ね順調に進捗している。
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| Strategy for Future Research Activity |
本年度単離した各種変異型Avt4を染色体から発現する株を用いて以下の解析を進める。1)単離液胞膜小胞を用いて、Avt4 N末端親水性領域の保存配列除去およびリン酸化部位のアラニン置換によるアミノ酸輸送活性への影響評価を行う。2)昨年度行ったリン酸化部位のアラニン置換体の解析では栄養豊富条件での液胞内アミノ酸含量の変化は部分的であった。この結果は定常状態ではAvt4の活性変化が他のトランスポーターによって相補された可能性を示唆する。そこで飢餓条件から栄養豊富条件に移し、経時的に液胞内アミノ酸含量の回復を調べ、より顕著な活性への影響の検出を目指す。3)昨年度の解析で14-3-3タンパク質欠損株において栄養豊富条件での液胞内アミノ酸含量の変化を検出したが、Avt4の活性変化によるものではないことが示された。今後、窒素飢餓条件での14-3-3タンパク質とAvt4の相互作用と、液胞内アミノ酸含量およびAvt4のリン酸化状態への14-3-3タンパク質欠損の影響を検討する。Avt4のリポソームへの組み込みとその活性評価においては本年度調製したAvt4を組み込んだリポソームと精製F-ATPaseを用いて以下の解析を進める。4)両者を再構成し、ATP依存的なアミノ酸輸送活性を検出する。5)Avt4のN末端親水性領域を欠損すると液胞からのアミノ酸排出が増加する。この欠損変異型Avt4をF-ATPaseと共にリポソームへと再構成し、アミノ酸輸送活性への影響を評価する。これらの解析により前述1)で活性に変化が見られた変異型Avt4についてリポソームへと再構成し、速度論的解析を行う技術基盤を確立する。
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| Causes of Carryover |
物品の購入に充てるには残金が少額であるため、次年度の物品購入に加えることにより効率的な購入に使用したい。
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| Expenditure Plan for Carryover Budget |
プライマー（3,000~4,000円程度）の購入費用を補填する。
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