2016 Fiscal Year Research-status Report
イネ種子の発芽調節におけるエチレンシグナル伝達系のレドックス制御
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15K07400
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| Research Institution | Kyoto Prefectural University |
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Principal Investigator |
森田 重人 京都府立大学, 生命環境科学研究科, 講師 (20295637)
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| Project Period (FY) |
2015-04-01 – 2019-03-31
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| Keywords | 種子 / 発芽 / エチレン / レドックス制御 / イネ |
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| Outline of Annual Research Achievements |
本研究ではイネにおいて、レドックス制御に関わる酵素グルタレドキシンGRXC2;2とエチレンレセプターERS1の相互作用による発芽調節機構の解析を行っている。平成28年度には以下の3つの実験を行った。
１ GRXC2;2形質転換イネの解析：GRXC2;2過剰発現系統と抑制系統の登熟種子において、休眠誘導に関与する遺伝子ABI3とSdr4の発現を調査した。その結果、GRXC2;2の過剰発現／発現抑制により、これらの休眠関連遺伝子の発現が上昇／低下していた。またこれと一致して、エチレン応答性遺伝子ERF61とADH1の発現も上昇／低下していた。さらに、GRXC2;2抑制系統の完熟直後の種子を発芽させたところ、コントロール系統に比べ発芽率が高かったことから、休眠が弱まっていることが示された。以上の結果から、GRXC2;2はエチレンの作用を介して種子休眠を調節することで、発芽を抑制していることが示唆された。
２ GRXC2;2とERS1の相互作用の解析：ERS1がイネ細胞内でGRXC2;2と相互作用することをBiFC法により確認するため、両者をイネ培養細胞プロトプラストで発現させたが、相互作用を示す明確な蛍光は観察されなかった。各タンパク質の発現量が十分でなかった可能性や、ERS1が膜タンパク質であることが原因として考えられることから、今後コンストラクトの改良が必要と思われた。
３ 形質転換イネの作出：ERS1の発芽調節における役割を明らかにするために、ERS1の発現抑制系統を作出した。具体的には、CRISPR/Cas9ゲノム編集技術を用いてERS1のコード領域に変異を導入した形質転換イネを作出した。得られた形質転換体 (T0世代) において、ERS1遺伝子の標的部位に変異が導入されていることを確認した。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
3: Progress in research has been slightly delayed.
Reason
BiFC法によるGRXC2;2とERS1の相互作用確認については、明確な結果がいまだ得られていない。前述の通り、導入したタンパク質の発現量が十分でなかった可能性や、ERS1が膜タンパク質であることが原因として考えられる。またイネ培養細胞プロトプラストでERS1とGRXC2;2を共発現させ、ERS1がGRXC2;2により酸化還元を受けるかどうかを調査する計画となっていたが、未着手である。これは上記のGRXC2;2とERS1の相互作用を確認した後、実施する計画であったためである。
また酸化還元活性を持たない変異型GRXC2;2の過剰発現系統の作出を平成28年度に計画していたが、着手していない。これはERS1の抑制系統作出を優先して実施したためである。
またERS1に対する抗体の作製については現在進行中であり、特異的な抗体はまだ得られていない。
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| Strategy for Future Research Activity |
GRXC2;2とERS1の相互作用確認を引き続き継続するが、タンパク質の発現量を増加させる、膜結合ドメインを除去した形でERS1を発現させるなどの改良を行い、再度実施する。これらの改良を行ってもなおBiFC法によって相互作用が確認できない場合は、共免疫沈降法による検出を試みる。具体的な実験方法としては、イネ培養細胞プロトプラストにおいて、タグを付加したGRXC2;2とERS1をそれぞれ発現させ、各タグに対する抗体を用いて免疫沈降・検出を行う。これらの実験により相互作用が確認できた後、プロトプラスト一過的発現系において、GRXC2;2によるERS1の還元を調査する。
ERS1の発現抑制系統については、順調に変異導入系統が得られたことから、平成29年度で発現抑制の確認、後代の育成・種子増殖を行い、平成30年度に発芽・初期生長を調査する。なお同系統におけるERS1の発現抑制の確認には、ERS1に対する抗体が必要となることから、抗体作製を早急に進め、特異的抗体を得る。
また平成28年度に未実施であった、酸化還元活性を持たない変異型GRXC2;2の過剰発現系統の作出を、平成29年度に実施する。当初計画から遅れているが、平成29年度中に過剰発現系統を作出し、平成30年度前半に後代の育成・種子増殖を行い、年度後半で発芽・初期成長を調査する。
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| Causes of Carryover |
上記の通り平成28年度は、研究計画に対して進捗がやや遅れている。そのため試薬・器具などの物品費が予定を下回る金額となったため。
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| Expenditure Plan for Carryover Budget |
計画よりも遅れている実験については１年遅れで実施するため、それに伴い物品費が増加する予定である。また実験の結果次第で一部研究計画を変更する可能性があり、実験手法の変更に伴う試薬・器具等の支出増加を物品費で賄う予定である。
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