2016 Fiscal Year Research-status Report
医薬品原料βアミノ酸の光学分割に有用な新規アミノアシラーゼの構造機能相関解析
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15K07401
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| Research Institution | Tokyo Denki University |
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Principal Investigator |
夏目 亮 東京電機大学, 工学部, 教授 (60637651)
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2015-04-01 – 2018-03-31
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| Keywords | βアミノ酸 / 光学分割 / アミノアシラーゼ / 結晶構造解析 |
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| Outline of Annual Research Achievements |
βフェニルアラニンの光学分割に役立つR体特異的βフェニルアラニンアミノアシラーゼ(R-βPheAA)の構造機能相関を明らかにする目的で、H28年度は、Burkholderia属細菌由来R-βPheAAの結晶構造の高分解能化・精密化、Variovorax属細菌由来R-βPheAAの結晶構造解析、ならびにロボットを利用した回折像収集条件の確立に重点的に取り組んだ。
＜1. Burkholderia属細菌由来R-βPheAA＞ C末端His-tag融合型R-βPheAA(R-βPheAA-His)の結晶について、年度前半は難航したものの、年度後半には高確率でロボットを利用した回折像測定が成立する条件を確立した。その結果、2.6Å分解能まで構造を精密化できた。リガンドをソーキングした結晶構造解析も試みたが、まだソーキング条件を確立できていないのが現状である。
＜２.Variovorax属細菌由来のR-βPheAA＞ NativeのR-βPheAA-Hisについて、回折像を2.6Å分解能で収集することに成功し、結晶学的パラメータを決定した。セレノメチオニン置換酵素を用いたSe-SAD法による構造解析、Burkholderia属細菌由来R-βPheAAの結晶構造をモデルに用いた分子置換法による構造解析も試みたがまだ成功していない。
＜３．両微生物に由来する酵素の生化学解析＞ どちらの酵素についても基本的な生化学解析が完了し、どちらの酵素とも、N末端あるいはC末端にHisタグを融合させても、タグフリー型酵素と性質が同等であることがわかった。また、Variovorax属細菌由来酵素の方が、Burkholderia属細菌由来酵素よりも高性能であることがわかった。静的光散乱を利用した分子量分析の結果、溶液中での会合状態は、両酵素ともにホモダイマーであることを強く示唆する結果が得られた。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.
Reason
＜Burkholderia属細菌由来R-βPheAAの結晶構造解析＞ H28年度の主な実施計画は、Burkholderia属細菌由来R-βPheAAの結晶構造を決定し、高分解能データの測定条件を確立することであった。年度当初はロボットを利用した測定が成立せずに進展が危ぶまれたが、年度後半には同測定が成立するようになり、前年度に低分解能で構造を決定済みであったBurkholderia属細菌由来R-βPheAAの結晶構造の高分解能化・精密化が進展した。リガンドとの複合体構造の決定も目指したが、現状では成功していない。決定した構造情報をもとにBurkholderia属細菌由来R-βPheAAの部位特異的変異体の作成、及び生化学解析を進める計画ではあったが、これはまだ実行できていない。
＜Variovorax属細菌由来R-βPheAAの結晶構造解析＞ Burkholderia属細菌由来R-βPheAAの結晶構造解析が計画よりも若干遅れた一方で、結晶化条件の確立および回折像収集を計画していたVariovorax属細菌由来R-βPheAAについては、目的通りに結晶化条件を確立して回折像の収集に成功し、結晶学的パラメータを決定できた。
＜R-βPheAAの生化学的解析＞ 両微生物由来のHisタグ融合型酵素およびタグフリー型酵素の生化学解析については計画通りに完了した。また、静的光散乱を用いた分子量分析から、両微生物由来酵素は、どちらもホモダイマーであることがわかった。
上記を総合して、現在までの進捗状況として、２の「おおむね順調に進展している」を選択した。
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| Strategy for Future Research Activity |
＜１、Burhkholderia属細菌由来βPheAA＞
より高分解能な回折データの収集と構造精密化に取り組みつつ、リガンドをソーキングした結晶の構造解析も行い、基質結合部位を実験的に同定する。基質結合部位を形成するアミノ酸残基を洗い出し、部位特異的変異の導入、部位特異的変異体の生化学的解析を進め、活性中心残基、基質認識残基を同定する。反応性が低下した変異体を用いて、基質／基質アナログ、あるいは反応産物／反応産物アナログとの共結晶構造解析も試みる。これらを総合して、酵素反応触媒機構、基質特異性決定機構、構造情報に立脚して当該酵素の特性を明らかにする。
＜２、Variovorax属細菌由来βPheAA＞
再現よく結晶を作成できるようになったもののBurkholderia属細菌由来酵素をモデルとした分子置換法で構造を決定できなかったため、（１）セレノメチオニン置換Variovorax属細菌由来βPheAAの結晶化とSe-SAD法による構造解析、（２）特殊な放射光ビームラインでの測定が実現する場合はNative結晶を用いたS-SAD法による構造解析、（３）水銀などの重原子をソーキングした結晶を用いたSAD法による構造解析、を平行して試みる。
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