幅広いバクテリア種で汎用性のあるゲノム編集技術の開発

2015 Fiscal Year Research-status Report

• Project/Area Number: 15K07402
• Research Institution: Osaka Municipal Technical Research Institute
• Principal Investigator: 駒 大輔 地方独立行政法人大阪市立工業研究所, 環境技術研究部, 研究員 (80443547)
• Co-Investigator(Kenkyū-buntansha): 田中 重光 地方独立行政法人大阪市立工業研究所, 生物・生活材料研究部, 研究員 (20509822) ; 森芳 邦彦 地方独立行政法人大阪市立工業研究所, 環境技術研究部, 研究主任 (30416367)
• Project Period (FY): 2015-04-01 – 2019-03-31
• Keywords: Chromosome / CRISPR-Cas9 / Red recombinase / GFP / RFP

Outline of Annual Research Achievements

本年度は、来年度以降の研究を進めるためのプラスミド等の構築を行った。具体的には、Red recombinaseのシステムおよびT7RNAポリメラーゼの発現系に加えて、①CRISPR-Cas9のシステム②高発現プロモーターに連結したGFP③高発現プロモーターに連結したRFP、が必要となるために、これらを作製して機能を確認することを目指した。
はじめに、大腸菌の染色体を改変するためのCRISPR-Cas9のシステム（プラスミド）を構築し、本システムを用いて大腸菌の染色体に薬剤耐性遺伝子を導入できることを確認した。さらに、Cas9の発現を制御するプロモーターを変更することで、より効率的にシステムを働かせることを目指した。
一方、lacUV5などのいくつかの一般的なプロモーターを用いてGFPやRFPの発現を試みたが、染色体に1コピー導入した場合には有意な蛍光発色が見られなかった。、そこで、GFPおよびRFPを高活性な構成型のプロモーター（P3-BCD2）に連結して染色体に導入するためのプラスミドを構築した。P3-BCD2プロモーターを用いてこれらの遺伝子を発現させた場合には、1コピーのみの導入でも、RFPやGFPの高発現によって菌株がピンク色および（UV照射下で）緑色になることを確認した。
来年度以降、Red recombinaseとT7システム、またはCas9とT7システムを組み合わせた環状DNAを用いて、作製したGFPやRFP遺伝子を大腸菌の染色体に効率よく導入するための検討を行う。

Current Status of Research Progress

3: Progress in research has been slightly delayed.

Reason

プラスミドや環状DNAの作製に際して、今後の研究展開を見据えてラボ内で新たな手法を取り入れる（Gibsonリアクション、より簡便に環状DNAを作製できる）こととしたために、その導入に際して時間を要した。しかしながら、来年度以降はこの手法を用いることで、極めて効率的に研究を推進することが可能となった。

Strategy for Future Research Activity

本年度に用意した研究材料を用い、これらをさらに組み合わせて、独自の環状DNA（非プラスミド型)を構築する。大腸菌をモデルとして、この環状DNAが大腸菌の染色体加工においてワークすることを確認する。また、より効率的にワークさせるための条件についても検討する。

Causes of Carryover

国内学会への参加を見送り、次年度に開催される国際学会への参加を決めたため、旅費を次年度に持ち越すことにした。また、研究支援のためのソフトウェア購入を検討していたが、新バージョンが登場する次年度に購入することに決めた。

Expenditure Plan for Carryover Budget

差額の持越し分は国際学会への参加費と、研究支援ソフトウェアの購入に使用する予定である。