2016 Fiscal Year Research-status Report
幅広いバクテリア種で汎用性のあるゲノム編集技術の開発
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15K07402
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| Research Institution | Osaka Municipal Technical Research Institute |
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Principal Investigator |
駒 大輔 地方独立行政法人大阪市立工業研究所, 環境技術研究部, 研究員 (80443547)
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| Co-Investigator(Kenkyū-buntansha) |
田中 重光 地方独立行政法人大阪市立工業研究所, 生物・生活材料研究部, 研究員 (20509822)
森芳 邦彦 地方独立行政法人大阪市立工業研究所, 環境技術研究部, 研究主任 (30416367)
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| Project Period (FY) |
2015-04-01 – 2019-03-31
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| Keywords | Chromosome / GFP / Red recombinase / 相同組換え / 大腸菌 |
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| Outline of Annual Research Achievements |
本年度は遺伝子を大腸菌に導入して蛍光を発するための環状DNAのもととなるプラスミドを作製した。すなわち、遺伝子発現を増幅するためのT7RNAポリメラーゼ遺伝子を構成性のプロモーターに連結し、一方、大腸菌用にコドンを最適化したGFP遺伝子をT7RNAプロモーターに連結して、これらを1つのプラスミド上に配置した。このプラスミドで大腸菌を形質転換することで、誘導剤を添加しなくても大腸菌が緑色蛍光を発することを確認した。また、このプラスミドを適切な制限酵素で処理してセルフライゲーションすることで、T7RNAポリメラーゼ遺伝子とGFP遺伝子のみからなる非プラスミド型の環状DNAを作製した（プラスミド上の複製起点と薬剤耐性遺伝子を除いたもの）。この非環状型DNAを用いて大腸菌が蛍光を発するかどうか現在確認している途中である。
さらにGFP遺伝子をλファージの組み換え酵素であるRed recombinaseに変更するためのプライマー、およびT7RNAポリメラーゼ遺伝子の発現に関する構成性プロモーターの種類を変更するためのプライマーなどを設計した。これらのプライマーを用いて、次年度で相同組換えのための非環状型DNAを作製する。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
3: Progress in research has been slightly delayed.
Reason
構成的に発現するT7RNAポリメラーゼ遺伝子とT7RNAプロモーターにより高発現するGFPを同時にコードするプラスミドを作製する際に、形質転換体がなかなか得られずに実験が遅れた。最終的に低コピーのプラスミドを用いることで問題を解決した。
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| Strategy for Future Research Activity |
非プラスミド型の環状DNAを用いて大腸菌が緑色蛍光を発することを確認する。さらにGFP遺伝子を相同組換え酵素に変更し、非プラスミド型の環状DNAを用いて大腸菌内で効率的に相同組換えを起こして、目的遺伝子を染色体DNAに導入できることを確認する。その際に、T7RNAポリメラーゼ遺伝子を発現させるための構成性プロモーターをさまざまに変更することで、効率的に遺伝子を導入できる系を構築する。
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| Causes of Carryover |
次年度以降に実験に必要な装置を購入するために未使用金を計上した。
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| Expenditure Plan for Carryover Budget |
様々な温度で形質転換した微生物を培養する必要が生じるため、翌年度分として請求した助成金と併せて、微生物の培養を行うための装置を購入する（50万円以下）。
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