2019 Fiscal Year Annual Research Report
Development of new genome editing method applicable to broad-range of bacteria
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15K07402
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| Research Institution | Osaka Research Institute of Industrial Science and Technology |
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Principal Investigator |
駒 大輔 地方独立行政法人大阪産業技術研究所, 森之宮センター, 主任研究員 (80443547)
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| Co-Investigator(Kenkyū-buntansha) |
田中 重光 地方独立行政法人大阪産業技術研究所, 森之宮センター, 研究員 (20509822)
森芳 邦彦 地方独立行政法人大阪産業技術研究所, 森之宮センター, 主任研究員 (30416367)
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| Project Period (FY) |
2015-04-01 – 2020-03-31
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| Keywords | 染色体 / 大腸菌 / 微生物 / ゲノム編集 / 相同組換え / Cas9 |
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| Outline of Annual Research Achievements |
まず初めに、プラスミドにコードした相同組換え酵素（Red-recombinase）遺伝子を用いて、大腸菌の染色体に任意の遺伝子を導入する実験系を確立した。また、ゲノム編集酵素（Cas9）遺伝子を用いて、同様の実験系を確立した。
一方、ゲノム編集の効果を見るための菌株として、GFPを構成的に高発現する大腸菌を作製した。本株は常時強力な緑色蛍光を発しており、プラスミドにコードしたCRISPR-Cas9を用いて、蛍光を消失させることに成功した。
これらを踏まえて、プラスミドフリーな相同組換えおよびプラスミドフリーなゲノム編集実験を行った。プラスミドフリーな相同組換えのために、一過的にRed-recombinaseを高発現するための環状DNAを作製した。Red-recombinaseをT7プロモーター下に配置したDNAを作製し、一方、構成的プロモーター下にT7RNAポリメラーゼを配置したDNAを作製した。これらをPCRで1つのインサートとして連結した後、TOPOベクターに連結した。この組換えプラスミドは「T7RP-Red」のソースとした。次に、「T7RP-Red」配列（プラスミドからレプリコンと抗生物質耐性遺伝子の配列を除いた配列）をPCRで増幅し、セルフライゲーションによって（プラスミドではない）環状DNAを得た。同様のスキームで、「T7RP-Cas9」を得た。
次に「T7RP-Red」を用いて、大腸菌の相同組換えにより大腸菌の染色体にカナマイシン耐性遺伝子を導入することを試みた。その結果、カナマイシン耐性を有する大腸菌が得られた。したがって、プラスミドを用いずに染色体を改変することが可能であることが示された（T7RP-Cas9」環状DNAを用いて先ほどのGFP蛍光発光する大腸菌のゲノム編集を行い、蛍光の消失を試みたが、蛍光の消失した菌株は得られていない）。
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