合成ユビキノンプローブを駆使したミトコンドリアVDACの分子機構解明

2015 Fiscal Year Research-status Report

• Project/Area Number: 15K07411
• Research Institution: Kyoto University
• Principal Investigator: 村井 正俊 京都大学, (連合)農学研究科(研究院), 助教 (80543925)
• Project Period (FY): 2015-04-01 – 2018-03-31
• Keywords: ユビキノン / ミトコンドリア / 光親和性標識 / クリックケミストリー

Outline of Annual Research Achievements

ユビキノンに代表されるキノン類は、バクテリアから高等生物に至るまで幅広く分布する生理活性分子であり、その主な役割は呼吸鎖電子伝達系における電子伝達担体としてはたらくことである。また、近年の研究では、電子伝達には直接関与しないものの、ユビキノンを“補因子”として持つことで機能する「ユビキノン結合性タンパク質」の存在が幾つか示唆されている。ミトコンドリア外膜に存在する電位依存性アニオンチャンネル（VDAC）は、そうしたユビキノン結合性タンパク質の候補の一つであり、いわゆる膜透過性亢進と呼ばれるシトクロムcの細胞質への漏出など、アポトーシスの鍵現象に深く関与することが知られている。ユビキノンが膜透過性亢進の制御に関与するという報告は知られていたが、両者の相互作用を明確に実証した例はこれまでにない。
ユビキノンのキノン環とイソプレン側鎖末端に、アジド基とアルキンをそれぞれ導入したユビキノンプローブを合成した（UQ-1）。本化合物は光親和性標識実験後に、クリックケミストリー（[3+2]環化付加反応）を利用して任意のタグを導入し、様々な生化学解析に供することを意図して設計した。出芽酵母から単離したミトコンドリアを、UQ-1によって光親和性標識し、クリックケミストリーによって各種タグ（図1）を導入した。蛍光タグ（TAMRA）を導入したサンプルは、電気泳動後のゲルの蛍光観察を行なうことで、また、ビオチンタグを導入したサンプルは、アビジン沈降によるタンパク質の精製やウエスタンブロットを行なうことで、標識を受けたタンパク質の解析を進めた。その結果、ユビキノンがVDACに対して特異的な結合親和性を示すことを初めて見出した。また、プロテアーゼ限定消化によって、VDACにおけるUQ-1の結合部位をC末端付近のPhe221-Lys234に限定することに成功した。

Current Status of Research Progress

2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.

Reason

細胞死の初動反応の過程にユビキノンが関与することが複数の研究者によって示唆されてきたが、その標的となるタンパク質は不明であった。本研究は、VDACとユビキノンの直接的な相互作用を有機化学的な手法で実証した初めての成果であり、研究は概ね順調であると考えている。

Strategy for Future Research Activity

これまでの研究で、VDACにおけるUQ-1の結合部位をC末端付近のPhe221-Lys234に限定することに成功した。今後は、当該領域の保存性の高いアミノ酸残基に変異を導入した酵母変異株を作成し、光親和性標識の効率の変動や、酸化的リン酸化への影響などを精査し、ユビキノンとVDACとの関係を総合的に考察する予定である。

Causes of Carryover

平成27年度は生化学実験の比重が大きかったため、有機合成関連の試薬購入費用として計上していた予算に余剰金が生じた。

Expenditure Plan for Carryover Budget

平成28年度は、ユビキノンプローブの改良も計画しているので、27年度の余剰金を有機合成関連の試薬購入日として利用する予定である。

Research Products

• [Journal Article] Current topics on inhibitors of respiratory complex I (2016)
  • Author(s): Murai, M. and Miyoshi, H.
  • Journal Title: Biochim. Biophys. Acta (Bioenergetics) Volume: 1857 Pages: in press
  • DOI: 10.1016/j.bbabio.2015.11.009
  • Peer Reviewed / Acknowledgement Compliant
• [Journal Article] Reduction of synthetic ubiquinone QT catalyzed by bovine mitochondrial complex I is decoupled with proton translocation (2016)
  • Author(s): Okuda, K., Murai, M., Aburaya, S., Aoki, W. and Miyoshi, H.
  • Journal Title: Biochemistry Volume: 55 Pages: 470-481
  • DOI: 10.1021/acs.biochem.5b01090
  • Peer Reviewed / Acknowledgement Compliant
• [Journal Article] Production of new amilorides as potent inhibitors of mitochondrial respiratory complex I (2015)
  • Author(s): Murai,M., Habu,S., Murakami, S., Ito, T., and Miyoshi, H.
  • Journal Title: Bioscience, biotechnology, and biochemistry Volume: 79 Pages: 1061-1066
  • DOI: 10.1080/09168451.2015.1010479
  • Peer Reviewed / Acknowledgement Compliant
• [Journal Article] Identification of the binding position of amilorides in the quinone binding pocket of mitochondrial complex I (2015)
  • Author(s): Ito, T. Murai, M., Morisaka, H., and Miyoshi, H.
  • Journal Title: Biochemistry Volume: 54 Pages: 3677–3686
  • DOI: 10.1021/acs.biochem.5b00385
  • Peer Reviewed / Acknowledgement Compliant
• [Journal Article] Amilorides bind to the quinone binding pocket of bovine mitochondrial complex IAmilorides bind to the quinone binding pocket of bovine mitochondrial complex I (2015)
  • Author(s): Murai, M., Murakami, S., Ito, T., and Miyoshi, H.
  • Journal Title: Biochemistry Volume: 54 Pages: 2739-2746
  • DOI: 10.1021/acs.biochem.5b00187
  • Peer Reviewed / Acknowledgement Compliant
• [Presentation] ミトコンドリア複合体-Iによる合成ユビキノンQTの還元はプロトン輸送と共役しない (2016)
  • Author(s): 奥田健司、村井正俊、油屋駿介、青木航、三芳秀人
  • Organizer: 日本農芸化学会2016年度大会
  • Place of Presentation: 札幌コンベンションセンター
  • Year and Date: 2016-03-27 – 2016-03-30
• [Presentation] トシル化学によるミトコンドリア複合体-Iのユビキノン結合部位の特異的メチル化 (2016)
  • Author(s): 稲岡宏幸、村井正俊、桝谷貴洋、油屋駿介、青木航、三芳秀人
  • Organizer: 日本農芸化学会2016年度大会
  • Place of Presentation: 札幌コンベンションセンター
  • Year and Date: 2016-03-27 – 2016-03-30
• [Presentation] 出芽酵母ミトコンドリアVDACはユビキノンと特異的に結合する (2016)
  • Author(s): 奥田絢香、村井正俊、山本武範、篠原康雄、三芳秀人
  • Organizer: 日本農芸化学会2016年度大会
  • Place of Presentation: 札幌コンベンションセンター
  • Year and Date: 2016-03-27 – 2016-03-30
• [Presentation] ミトコンドリア複合体-I阻害剤としてのアミロライド類の作用機構研究 (2016)
  • Author(s): 伊藤剛、村井正俊、村上園実、森坂裕信、三芳秀人
  • Organizer: 日本農薬学会第41回大会
  • Place of Presentation: 島根大学
  • Year and Date: 2016-03-17 – 2016-03-19
• [Presentation] ミトコンドリア複合体-Iによる合成ユビキノンQTの還元はプロトン輸送と共役しない (2016)
  • Author(s): 桝谷貴洋，奥田健司，村井正俊，三芳秀人
  • Organizer: 日本農薬学会第41回大会
  • Place of Presentation: 島根大学
  • Year and Date: 2016-03-17 – 2016-03-19
• [Presentation] ミトコンドリア呼吸鎖活性を制御するユビキノン結合性タンパク質Coq10の機能 (2016)
  • Author(s): 村井正俊、三芳秀人
  • Organizer: 日本農薬学会第41回大会（シンポジウム）
  • Place of Presentation: 島根大学
  • Year and Date: 2016-03-17 – 2016-03-19
  • Invited
• [Presentation] アミロライド類のミトコンドリア複合体-Iにおける結合部位の同定 (2015)
  • Author(s): 伊藤剛、村井正俊、村上園実、森坂裕信、三芳秀人
  • Organizer: 第30回農薬デザイン研究会
  • Place of Presentation: メルパルク京都
  • Year and Date: 2015-11-12 – 2015-11-12
• [Presentation] ミトコンドリア複合体-Iのピンポイント化学修飾 (2015)
  • Author(s): 桝谷貴洋、村井正俊、森坂裕信、三芳秀人
  • Organizer: 第30回農薬デザイン研究会
  • Place of Presentation: メルパルク京都
  • Year and Date: 2015-11-12 – 2015-11-12
• [Presentation] Amilorides bind to the quinone binding pocket of bovine mitochondrial complex I (2015)
  • Author(s): Murai M, Miyoshi H
  • Organizer: Gordon Research Conference on Bioenergetics
  • Place of Presentation: Proctor Academy (USA)
  • Year and Date: 2015-06-21 – 2015-06-21
  • Int'l Joint Research
• [Remarks] 所属研究室ホームページ
  • URL: http://www.biofunc-chem.kais.kyoto-u.ac.jp
• [Remarks] Google Scholar
  • URL: https://scholar.google.co.jp/citations?user=I66ybkoAAAAJ&hl=ja
• [Remarks] Research map
  • URL: http://researchmap.jp/read0145924/?lang=japanese