合成ユビキノンプローブを駆使したミトコンドリアVDACの分子機構解明

2016 Fiscal Year Research-status Report

• Project/Area Number: 15K07411
• Research Institution: Kyoto University
• Principal Investigator: 村井 正俊 京都大学, 農学研究科, 助教 (80543925)
• Project Period (FY): 2015-04-01 – 2018-03-31
• Keywords: ユビキノン / VDAC / 光親和性標識 / ミトコンドリア / クリックケミストリー

Outline of Annual Research Achievements

ユビキノンに代表されるキノン類は、呼吸鎖電子伝達系における電子伝達担体としてはたらき、バクテリアから高等生物に至るまで幅広く分布する生理活性分子である。一方、最近の研究では、電子伝達には直接関与しないものの、ユビキノンを“補因子”として持つことで機能する「ユビキノン結合性タンパク質」の存在が幾つか示唆されている。ミトコンドリア外膜に存在する電位依存性アニオンチャンネル（VDAC）は、そうしたユビキノン結合性タンパク質の候補の一つであり、いわゆる膜透過性亢進と呼ばれるシトクロムcの細胞質への漏出など、アポトーシスの鍵現象に深く関与することが知られているが、両者の相互作用を明確に実証した例はこれまでにない。本研究では、出芽酵母ミトコンドリアを実験材料として、独自に合成したユビキノンプローブを用いた光親和性標識実験を切り口に、VDACとユビキノンの関係を明らかにすることを目的とした。

ユビキノンのキノン環とイソプレン側鎖末端に、アジド基とアルキンをそれぞれ導入したユビキノンプローブを合成し、 PUQ-1がVDAC1に特異的に結合していることを明らかにした。さらに、プロテアーゼ限定分解によって、PUQ-1の結合部位はVDAC1のC末端付近のPhe221-Lys234に存在することを明らかにした。ユビキノンとVDACの相互作用の生理的な意義を考察する目的で、出芽酵母ミトコンドリアの膜透過性亢進におけるユビキノンの影響について精査した。その結果、PUQ-1はCa+で誘導される膜透過性亢進を低濃度で抑制した。これらの実験結果は、ユビキノンとVDAC1の相互作用を初めて直接的に実証したものであり、ユビキノンがVDACに特異的に結合することで膜透過性亢進が制御されることを示唆するものである。

Current Status of Research Progress

2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.

Reason

ユビキノンのVDACにおける結合部位が、そのC末端付近のPhe221-Lys234に存在することを明らかにした。また、出芽酵母ミトコンドリアの膜透過性亢進におけるユビキノンの影響について精査した結果、PUQ-1はCa+で誘導される膜透過性亢進を低濃度で抑制することを明らかにした。これらの一連の実験結果は、ユビキノンとVDAC1の相互作用を初めて直接的に実証したものであり、ユビキノンがVDACに特異的に結合することで膜透過性亢進が制御されることを示唆するものである。

以上の理由から、研究は概ね順調に進展していると言える。

Strategy for Future Research Activity

ユビキノンとVDACの相互作用についてはほぼ完全に証明することが出来た。最終年度は、膜透過性亢進とVDACとの関係について、ユビキノンの役割を軸にさらに詳細に解析を進めたいと思う。

Causes of Carryover

昨年度は、生化学実験を重点的に実施したため、有機合成用の試薬として計上した予算の使用率が低かった。

Expenditure Plan for Carryover Budget

本年度は、ユビキノンプローブの構造展開を進める予定であり、昨年度の余剰金額をこの目的で使用する予定である。

Research Products

• [Journal Article] Synthetic ubiquinones specifically bind to mitochondrial voltage-dependent anion channel 1 (VDAC1) in Saccharomyces cerevisiae mitochondria (2017)
  • Author(s): Murai, M., Okuda, A., Yamamoto, T, Shinohara, Y. and Miyoshi, H.
  • Journal Title: Biochemistry Volume: 56 Pages: 570-581
  • DOI: 10.1021/acs.biochem.6b01011
  • Peer Reviewed / Acknowledgement Compliant
• [Journal Article] SARを基盤にミトコンドリア複合体-I阻害剤の作用機構を考える (2017)
  • Author(s): 三芳秀人，村井正俊
  • Journal Title: 日本農薬学会誌 Volume: 42 Pages: 44-48
  • DOI: 10.1584/jpestics.W17-09
• [Journal Article] ミトコンドリア呼吸鎖活性を制御するユビキノン結合性タンパク質Coq10の機能 (2017)
  • Author(s): 村井正俊，三芳秀人
  • Journal Title: 日本農薬学会誌 Volume: 42 Pages: 65-70
  • DOI: 10.1584/jpestics.W17-19
• [Journal Article] Specific methylation of Asp160 (49 kDa subunit) located inside the quinone binding cavity of bovine mitochondrial complex I (2016)
  • Author(s): Murai, M., Inaoka, H., Masuya, T., Aburaya, S., Aoki, W. and Miyoshi, H.
  • Journal Title: Biochemistry Volume: 55 Pages: 3189-3197
  • DOI: 10.1021/acs.biochem.6b00190
  • Peer Reviewed / Acknowledgement Compliant
• [Journal Article] Characterization of the reaction of decoupling ubiquinone with bovine mitochondrial respiratory complex I (2016)
  • Author(s): Masuya, T., Okuda, K., Murai, M. and Miyoshi, H.
  • Journal Title: Biosci. Biotechnol. Biochem. Volume: 80 Pages: 1464-1469
  • DOI: 10.1080/09168451.2016.1179095
  • Peer Reviewed / Acknowledgement Compliant
• [Presentation] 合成ユビキノンは出芽酵母ミトコンドリア電位依存性アニオンチャンネル（VDAC）に特異的に結合する (2017)
  • Author(s): 村井正俊、奥田絢香、山本武範、篠原康雄、三芳秀人
  • Organizer: 日本農芸化学会2017年度大会
  • Place of Presentation: 京都女子大学
  • Year and Date: 2017-03-20
• [Presentation] コレラ菌NADH-キノン酸化還元酵素の特異的阻害剤コロルミシンの単離と全合成 (2017)
  • Author(s): 伊藤剛、戸崎龍彦、村井正俊、Barquera B, 三芳秀人
  • Organizer: 日本農芸化学会2017年度大会
  • Place of Presentation: 京都女子大学
  • Year and Date: 2017-03-20
• [Presentation] ミトコンドリア呼吸鎖複合体-Iの位置特異的化学修飾 (2017)
  • Author(s): 桝谷貴洋、村井正俊、三芳秀人
  • Organizer: 日本農芸化学会2017年度大会
  • Place of Presentation: 京都女子大学
  • Year and Date: 2017-03-20
• [Presentation] トシル化学によるミトコンドリア複合体-Iのユビキノン結合部位の特異的メチル化 (2017)
  • Author(s): 桝谷貴洋、稲岡宏幸、村井正俊、三芳秀人
  • Organizer: 日本農薬学会第42回大会
  • Place of Presentation: 愛媛大学
  • Year and Date: 2017-03-08
• [Presentation] 合成ユビキノンは出芽酵母ミトコンドリア電位依存性アニオンチャンネル（VDAC）に特異的に結合する (2017)
  • Author(s): 村井正俊、奥田絢香、山本武範、篠原康雄、三芳秀人
  • Organizer: 日本農薬学会第42回大会
  • Place of Presentation: 愛媛大学
  • Year and Date: 2017-03-08
• [Presentation] コレラ菌NADH-キノン酸化還元酵素の阻害剤コロルミシンの単離と全合成研究 (2017)
  • Author(s): 伊藤剛、戸崎龍彦、村井 正俊、Blanca Barquera, 三芳 秀人
  • Organizer: 日本農薬学会第42回大会
  • Place of Presentation: 愛媛大学
  • Year and Date: 2017-03-08
• [Presentation] ミトコンドリア呼吸鎖複合体-Iにおける合成ユビキノンQTの還元はプロトン輸送と共役しない (2016)
  • Author(s): 村井正俊、奥田健司、桝谷貴洋、三芳秀人
  • Organizer: 日本生体エネルギー研究会第42回討論会
  • Place of Presentation: 名古屋工業大学
  • Year and Date: 2016-12-19
• [Presentation] ミトコンドリア呼吸鎖複合体-Iの位置特異的化学修飾 (2016)
  • Author(s): 桝谷貴洋、村井正俊、稲岡宏幸、三芳秀人
  • Organizer: 日本生体エネルギー研究会第42回討論会
  • Place of Presentation: 名古屋工業大学
  • Year and Date: 2016-12-19
• [Presentation] Identification of the binding site of amilorides in mitochondrial respiratory complex I (2016)
  • Author(s): Ito T, Murai M and Miyoshi H
  • Organizer: 18th European Bioenergetics Conference (EBEC2016)
  • Place of Presentation: Riva del Garda Congressi, Italy
  • Year and Date: 2016-07-02
  • Int'l Joint Research
• [Presentation] Synthetic ubiquinones specifically bind to mitochondrial voltage-dependent anion channel of Saccharomyces cerevisiae (2016)
  • Author(s): Murai M, Okuda A, Yamamoto T, Shinohara Y and Miyoshi H
  • Organizer: 18th European Bioenergetics Conference (EBEC2016)
  • Place of Presentation: Riva del Garda Congressi, Italy
  • Year and Date: 2016-07-02
  • Int'l Joint Research
• [Presentation] Site-specific chemical modifications of the quinone binding cavity of bovine heart mitochondrial complex I (2016)
  • Author(s): Masuya T, Murai M, Inaoka H and Miyoshi H
  • Organizer: 18th European Bioenergetics Conference (EBEC2016)
  • Place of Presentation: Riva del Garda Congressi, Italy
  • Year and Date: 2016-07-02
  • Int'l Joint Research
• [Remarks] 所属研究室ホームページ
  • URL: http://www.biofunc-chem.kais.kyoto-u.ac.jp
• [Remarks] Google Scholar
  • URL: https://scholar.google.com/citations?user=I66ybkoAAAAJ&hl=ja